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SOX6在膀胱癌发生发展中的作用及相关机制

2019-09-03付真睿盛飞张昌文常泰浩陈仕洋乔宝民

天津医科大学学报 2019年4期
关键词:蛋白酶体膀胱癌孵育

付真睿,盛飞,张昌文,常泰浩,陈仕洋,乔宝民

(天津医科大学第二医院泌尿外科,天津市泌尿外科研究所,天津300211)

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,美国癌症协会预估2017年膀胱癌新增病例79 030例,死亡病例16 870例[1],尽管大多数的膀胱癌为非肌层浸润性的(70%~75%),但它们会随着时间的推移而转移并最终发展为肌层浸润性疾病(25%~30%)[2]。膀胱癌的治疗方法包括手术、化学疗法或放射疗法,但生存益处仍然有限,其发病率和死亡率在过去10年中逐渐增加[3]。因此,迫切需要提高对膀胱癌的认识并发现可用于治疗膀胱癌更有效、高选择性的潜在治疗靶点。SOX6为SOX基因家族D亚族的主要成员之一,SOX家族蛋白作为转录因子主要参与调控胚胎发育、性别决定、神经生长、血管生成、骨骼形成、干细胞形成等生长发育过程[4-5],近年来,越来越多的研究表明SOX6的异常表达与许多肿瘤相关[6-12]。蛋白酶体作为细胞蛋白质的一种降解途径,很多疾病发生发展也与之直接相关。蛋白酶体作为新型抗肿瘤药物的一个重要靶标,当蛋白酶体活性受到抑制后,其相关受体蛋白的降解受到抑制[13-15]。对SOX6通过蛋白酶体途径影响膀胱癌生长进程的机制研究将有助于提升笔者对膀胱癌的认识和治疗。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂 人膀胱癌组织与癌旁组织获取于天津医科大学第二医院泌尿外科,膀胱癌细胞系(T24、BIU-87、EJ、5637)和正常膀胱上皮细胞(SVHUC-1)来自天津医科大学第二医院泌尿外科研究所。兔单抗SOX6、兔单抗E-cadherin、兔单抗Vimentin、一抗兔单抗GAPDH、二抗羊抗兔购于proteintech公司,SOX6高表达质粒 pcDNA3.1-SOX6和空载质粒购于广东复能基因公司。X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂购于美国Roche公司,CCK8试剂盒、免疫组化试剂盒、多聚甲醛、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于Solarbio公司,Transwell小室购于美国Corning公司,ECL显影液、SYBR Green预混液、蛋白Marker购于美国Thermo Fisher公司,细胞凋亡试剂盒、caspase3试剂盒、RNA反转录相关试剂购于康为世纪公司,Matrigel基质胶购于美国BD公司,Trizol试剂购于Invitrogen公司,20 s蛋白酶体检测试剂盒购于Sigma-Aldaich公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 人膀胱癌细胞系培养于含10%FBS的RPMI 1640培养液中,置于37℃,5%CO2饱和湿度条件下培养。每2~3d更换培养液1次,待细胞生长融合率达到80%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化,按1:2进行传代培养。取对数生长期,状态良好的膀胱癌细胞于6孔板中,待细胞长至50%时按转染试剂说明书进行转染。

1.2.2 免疫组化 组织标本以10%甲醛液固定24 h,常规石蜡包埋,制备4 μm切片,贴附于涂有APES处理的载玻片上,85℃烤片90 min,免疫组织化学染色:(1)石蜡切片脱蜡;(2)3%H2O2室温孵育5~10 min,以清除内源性过氧化物酶的活性,蒸馏水冲洗,PBS 浸泡 5 min;(3) 微波抗原修复;(4)5%~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10 min,倾去血清,分别滴加一抗工作液,37℃孵育 1~2 h,PBS冲洗,5 min×3次;(5)滴加生物素标记的二抗,37℃孵育 20~30 min,PBS冲洗,5 min×3 次;(6)滴加辣根酶标记链酶卵白素,37℃孵育20~30 min,PBS冲洗,5 min×3 次;(7)DAB 显色;(8)自来水充分冲洗、复染、封片。用已知阳性标本作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.3 Western blot提取细胞总蛋白 用BCA法测定蛋白浓度,取30~40 μg总蛋白上样,经SDS-PAGE凝胶电泳后,转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉摇床上室温封闭2 h,一抗4℃孵育过夜,TBST溶液洗3次,每次15 min。HRP标记的二抗按照1∶1 500稀释,室温下孵育1 h,使用TBST溶液洗3次,每次15 min,滴加显色剂,置于曝光仪内显影。

1.2.4 荧光实时定量PCR(qRT-PCR) 使用Trizol试剂法提取细胞RNA,使用核酸定量分析仪测定RNA浓度,反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,再使用荧光定量PCR分析仪对cDNA进行扩增检测,以GAPDH为内参,反应程序如下:94℃3 min(预变性),94℃30 s(变性),56℃ 30 s(退火),72℃60 s(延伸),72℃ 5 min(最后延伸),42~45个循环。反应完成后软件分析结果(表1)。

表1 突变引物对Tab 1 Mutation primers

1.2.5 Transwell实验 实验参照Transwell 24孔板(美国Corning公司)说明书操作。胰酶消化收集细胞,应用含0.5%血清的培养基重悬细胞,接种细胞于铺好Matrigel基质胶的Transwell小室,使细胞数为2×104个/孔,下室加入500 μL含10%血清的培养基。37℃培养箱中孵育24 h后,移去培养液,用乙醇棉签擦拭去除小室底膜内侧细胞,小心取出上室,用预冷的50%甲醇固定10 min,PBS清洗3遍,结晶紫染色10 min,于倒置荧光显微镜下观察5个视野的细胞数。

1.2.6 细胞划痕实验 处理后的单细胞悬液接种于6孔板内,待培养细胞至90%,用20 μL移液枪头垂直划痕,无菌PBS冲洗悬浮细胞及碎片2次,培养24h后,倒置显微镜观察划痕愈合情况。

1.2.7 细胞凋亡 实验细胞转染48 h后不含EDTA胰酶消化后,300 r/min,4℃离心5 min收集细胞,按照细胞凋亡试剂盒说明书加入结合缓冲液、AnnexinV和PI,6h内在流式细胞仪上检测凋亡指数。

1.2.8 CCK-8实验 96孔板中加入100 μL细胞悬液,将培养板在培养箱中预培养24 h,在0、24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8溶液,将培养板在培养箱孵育1~4 h,酶标仪读取待测样品和空白对照在450 nm处的OD值,将各待测样本的OD值记为测量值,空白对照的OD值记为空白值,则实际数值=测量值-空白值。

1.2.9 20 s蛋白酶体活性检测实验 避光96孔板中加入 90 μL(8×104)处理过的细胞,800 r/min 离心2 min,按说明书加入相关试剂,37°C,5%CO2过夜,在全波长多功能酶标仪上发射波长490 nm检测吸光度。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析。实验数据以±s表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌中SOX6表达水平 与癌旁组织相比膀胱癌组织中的染色强度显著减弱,可见SOX6蛋白表达在膀胱癌组织中明显降低。使用Western blot和qRT-PCR分别检测膀胱癌细胞和正常膀胱上皮细胞内SOX6蛋白水平与mRNA水平表达情况,结果显示膀胱癌细胞中SOX6的表达显著降低,在EJ和5637细胞尤其明显(图1)。

图1 SOX6在组织和细胞器中的表达情况Fig 1 The expression of SOX6 in tissues and cells

2.2 SOX6抑制膀胱癌侵袭和迁移能力 Transwell实验(图2)和划痕实验(图3)结果显示,与对照vector组相比,高表达SOX6后的EJ和5637细胞的侵袭能力显著下降。同时,上皮间质转化(EMT)的分子标记物E-cadherin蛋白表达升高,Vimentin表达减低(图4)。

图2 SOX6表达增加对膀胱癌EJ和5637细胞的侵袭能力的影响(40×)Effect of up-regulation SOX6 on invasion of EJ and 5637 (40×)

图3 SOX6表达增加对膀胱癌EJ和5637细胞的侵袭能力的影响(40×)Fig 3 Effect of up-regulation SOX6 on migration of EJ and 5637(40×)

图4 SOX6表达增加对膀胱癌的上皮间质转化的影响Fig 4 Influence of up-expression SOX6 onEpithelial-mesenchymal transition(EMT)of bladder cancer cells

2.3 SOX6抑制膀胱癌的增殖和促进凋亡 CCK-8实验和流式细胞术结果表明,与对照vector组相比,SOX6表达增加后能够抑制膀胱癌细胞EJ和5637的增殖,并且能够促进膀胱癌的凋亡,同时细胞caspase3的活性显著增加(图5)。

2.4 SOX6能够通过蛋白酶体途径影响膀胱癌的进程 与正常膀胱上皮细胞相比膀胱癌细胞EJ与5637的20 s蛋白酶体的活性相对增加,在膀胱癌细胞中调高SOX6的表达量后,20 s蛋白酶体的活性显著减低(图6)。

图5 SOX6表达增加对膀胱癌EJ和5637细胞的凋亡和增殖能力影响Fig 5 Influence of up-expression SOX6 on apoptosis and proliferation of EJ and 5637

图6 SOX6表达增加对膀胱癌EJ和5637细胞的20 s蛋白酶体活性的影响Fig 6 Influence of up-expression SOX6 on the activity of 20 sproteasome of EJ and 5637

3 讨论

SOX6作为多功能转录因子,主要调节组织分化并参与多种恶性肿瘤的发生发展。研究表明,SOX6的表达量与食管癌的预后显著相关,通过上调p53和p21WAF1/CIP1抑制食管癌的致瘤能力[8]。在胰腺癌中,SOX6通过抑制上皮间质转化和AKT通路抑制肿瘤的增殖和侵袭[9]。SOX6的表达抑制卵巢癌的增殖、侵袭、移植瘤生长和血管生成[6]。但是,SOX6和膀胱癌的关系目前还不清楚。

近年来,对于蛋白酶体的研究日益渐增,蛋白酶体作为一个多亚基大分子复合物,具有多种催化功能,能选择性降解细胞内的蛋白质,是细胞新陈代谢的一个重要组成部分[16]。相对于正常的细胞,肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂更加敏感,通过影响肿瘤细胞的相关通路从而抑制肿瘤细胞,同时,多种肿瘤中的蛋白酶体处于高活性状态[17]。因此,蛋白酶体渐渐成为抗肿瘤药物的一个靶点,当蛋白酶体活性被抑制时,肿瘤抑制蛋白p53的含量增加,促进细胞凋亡;免疫相关蛋白降解减少,免疫监视能力增加。

在本研究中,笔者发现了与膀胱的正常组织相比,膀胱癌中SOX6处于低表达状态,在体外实验中,通过增加SOX6的表达,发现膀胱癌的增殖、侵袭、迁移能力下降,凋亡增加。并进一步验证了蛋白酶体在膀胱癌中的活性情况,通过调高SOX6,意外发现膀胱癌细胞中的蛋白酶体活性减低。SOX6可能通过抑制蛋白酶体活性从而调节膀胱癌的肿瘤行为,在联合蛋白酶体抑制剂治疗膀胱癌方面有很好的前景。

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