树鼩大脑皮层少突胶质前体细胞的分离鉴定

李明学, 黎晓慧, 黄 鑫, 王 璇, 张志成, 袁 园, 陆彩霞, 孙晓梅

(1. 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所

树鼩种质资源中心, 昆明 650118； 2. 昆明医科大学, 昆明650500)

少突胶质细胞(oligodendrocytes, OLs)是中枢神经系统(central nervous system, CNS)髓鞘形成的唯一细胞, 起源于胚胎神经管腹侧的神经上皮细胞[1]。其主要功能是产生髓鞘包绕神经轴突，维持神经冲动沿轴突跳跃性传导。另外它还能分泌多种神经营养因子，支持神经元、胶质细胞的生长发育与存活[2]。OLs 在发育过程中, 大致经历了少突胶质祖细胞、 少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)、未成熟少突胶质细胞(immature oligodendrocyte)和成熟少突胶质细胞(mature oligodendrocyte)几个阶段[3]，其形态、功能和表达产物呈现连续渐变过程，各发育阶段没有严格界限之分。越来越多研究表明,OLs 异常在CNS 脱髓鞘病变[4]、神经元损伤[5]、精神疾病等的发病机制中起着重要作用[6-8]。有研究者[9]曾尝试将体外培养成熟的OLs 移植入髓鞘，对脱髓鞘病变的CNS 进行细胞治疗。但是，成熟的OLs 缺乏增殖和迁移能力，移植后并不能使病变受损部位形成具有正常功能的髓鞘。已有研究[10]证明，体外培养的OPCs 在一定的条件下可定向分化成为成熟的OLs，将体外培养OPCs移植入体内并诱导其分化为成熟的OLs 形成具有正常功能的髓鞘。那么, OPCs 将有可能成为治疗CNS 疾病或者损伤的理想细胞。所以，高纯度、高质量OPCs 的体外培养是该研究工作的基础。

树鼩是一种新型的实验动物，其生理、生化、解剖结构以及基因组等生物学特性比啮齿类更接近于非人灵长类，且大脑较发达，已被用于神经系统相关疾病的研究[11-13]。目前，国内外对大鼠、小鼠OPCs 的培养报道[3-9、14-16]很多，有关树鼩OPCs 的培养方法及研究尚无报道。本文探索树鼩OPCs 的培养及鉴定方法，为利用树鼩开展相关研究提供新的实验材料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新生48 h内的树鼩，由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供[SCXK(滇)K2018-0002]； 实验操作在本中心实验设施内进行[SYXK(滇)K2018-0001]，并遵循实验动物使用的3R 和福利伦理原则。

1.2 仪器与试剂

Forma A/B3(6Ft) 生物安全柜(美国，Forma)；CO2T/C 恒温培养箱(美国，Thermo)； ECLIPSE Ti 倒置显微镜(日本，Nikon)； L8-80M 超速离心机(德国，Hermle)； ZD-85 数显恒温振荡器(中国)：TOMY-SS-325 高压灭菌锅(日本, Tomy)； PBS(美国, Hyclone，SH30256.01B)； DMEM/F12 培养基(美国, Sigma, D8437)； FBS(Israel, BI, 04-001-1A)；胰蛋白酶(美国，Gibco)； D-Hank’s 液(美国，索莱宝，H1040)； DNase Ⅰ(德国，Applichem，D3778.0050)； Poly-D-lysine(美国，Sigma)； BSA(中国，Biosharp)； Anti-Myelin Basic Protein Antibody(髓鞘碱性蛋白, MBP； 美国, Sigma, M3821-100UG)；Anti-NG2 Antibody(硫酸软骨素蛋白多糖4，NG2,英国, Abcam, ab183929)； 人睫状神经细胞营养因子(CNTF； 美国, Cyagen, HEOPP-0301)； 三碘甲状原氨酸(T3； 德国, Millipore, 642511-10MG)； Human FGF-base (bFGF； 美国, PeproTech, 100-18B-50)；B-27 Supplement(50X)(美国, Invitrogen, 17504044)；Cy3 标记的驴抗兔荧光二抗(德国，Millipore，AP182C)； 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI； 美国，Sigma)。

1.3 细胞培养液

混合培养液： DMEM/F12+10%FBS+1%双抗；增殖培养液： DMEM/F12+10 ng/mL bFGF+1%FBS+2%B27+5 μg/mL 胰岛素+1% 双抗；分离液：DMEM/F12+0.02%EDTA+0.5%DNase I+5 μg/mL胰岛素+1%双抗； 分化培养液： DMEM/F12+30 ng/mL T3+10 ng/mL CNTF+2%B27+5 μg/mL 胰岛素+1%双抗。

1.4 方法

1.4.1 OPCs 分离 取新生48 h 内的树鼩, 实施安死术后在体积分数75%乙醇中浸泡15 s，取出后用PBS 冲洗两遍去乙醇。用眼科剪剪去头皮，镊子掀去头骨, 弯镊小心取出大脑, 置于装有D-Hanks液(4 ℃预冷)的无菌培养皿中，洗涤2 遍，去除血迹。用镊子从大脑腹侧及边缘小心地撕去脑膜和血管，去除脑干和小脑，夹取大脑皮层移入另一个装有D-Hanks液的无菌培养皿中洗涤1次，以上都在冰板上操作。将大脑皮层移入一无菌小瓶中，用眼科剪尽量将大脑皮层剪碎成模糊状，加入3 mL 0.25%胰酶和1 mL DNase I 消化，再用吸管吹打，制成细胞混悬液，放入37 ℃、5%CO2培养箱孵育5～10 min。加入混合培养液终止消化，吸管吹打混匀, 吸取细胞混悬液放入70 目细胞筛网中过滤一次, 使之分散成单个细胞。收集到15 mL 离心管中，1 000 r/min 离心10 min，弃去上清，留沉淀，加入混合培养液重悬细胞沉淀。将细胞悬液接种于普通25 cm2的培养瓶，放入培养箱中培养1 h，轻轻吸出细胞悬液(以去除已贴壁的成纤维细胞和较大的组织碎片)接种于预先用PDL 处理过的25 cm2的一次性细胞培养瓶中，然后将培养瓶放入培养箱培养。

1.4.2 OPCs增殖培养与纯化 原代混合细胞培养5 d 后，加入增殖液培养, 每日换液。2 d 后, 去除增殖培养液，PBS 清洗2 次, 加入分离液, 放入培养箱孵育10～15min。用吸管吸取培养液, 轻轻吹打细胞培养面，而后吸取细胞混悬液放入40目细胞筛网中过滤一次, 1 000 r/min 离心10 min，弃上清，留沉淀，加入混合培养液，将细胞悬液接种于未处理过的6孔板中, 放入培养箱中培养1 h。之后轻轻地吸取上清到PDL处理过的6孔板中培养1 min。最后轻轻吸出细胞悬液接种于预先用PDL 处理过的6 孔板中，然后放入培育箱过夜培养。弃混合培养液, 加入增殖液, 继续培养。

1.4.3 OPCs定向诱导分化 纯化过后的OPCs培养3 d 后，加入分化培养液定向分化，最后终止培养，吸出残余培养基，进行免疫荧光鉴定。

1.4.4 细胞形态学观察 取不同时间段培养的细胞，用倒置显微镜观察细胞形态及生长状态，并拍照记录。

1.4.5 细胞免疫荧光鉴定 去除培养液, 用PBS漂洗3 次，每次2 min； 质量分数4% 多聚甲醛固定20 min, PBS 漂洗3 次, 每次2 min； 0.5%Triton X-100室温穿孔20 min, PBS漂洗3次，每次2 min；5%的山羊血清室温封闭30 min，PBS 漂洗3 次，每次2 min； 对少突胶质前体细胞和OPCs 分别滴加稀释好的抗NG2、MBP(1∶200 稀释)一抗，对照孔加PBS 代替一抗，4 ℃过夜孵育，PBS 漂洗4 次，每次3 min； 避光条件下，加入Cy3 标记的驴抗兔荧光二抗，37 ℃孵箱1h，PBS 漂洗4 次，每次3 min； 滴加DAPI 避光孵育5 min, PBS清洗3 次, 每次2 min； 吸走液体, 加入抗荧光淬灭剂(1∶500 稀释), 在荧光显微镜下观察并拍照。1.2.6 MTT法测定OPCs生长曲线 纯化培养后,选取单层生长的细胞制成细胞悬液, 培养液稀释细胞浓度至1.5×104细胞/mL, 以每孔100 μL 接种于96 孔培养板中, 设2 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h 和96 h 共9 组，每组3 个复孔，空白调零组为不接种细胞只加培养液,于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养，分别按设置的时间点，每孔加入MTT 20 μL, 继续培养4 h, 去除培养液, 每孔加入200 μL DMSO, 37 ℃下溶解30 min，选择波长490 nm，以空白组调零，在酶标仪上测定各孔吸光度(A)值。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

经胰酶消化后刚接种的细胞悬浮于培养液中，呈圆形，折光性较强。接种10 min 就可见少量细胞开始贴壁，贴壁1 h 后转移至经PDL 处理过的培养瓶中, 8 h 后大部分细胞已贴壁。培养3 d后, 在荧光显微镜下观察, 细胞表面开始长出突起，且多数细胞的体积较大，紧贴于瓶底生长,胞核较大，呈圆形或长条形，细胞扁平状有较粗大的突起。少数为体积较小，胞体呈圆形或椭圆形, 具有单极或双极细小突起的强折光性的细胞(图1A ↑)。加入增殖培养液继续培养2 d 后，OPCs不断分裂增殖并呈现出典型的双极或三极形态、细胞核大、胞体较小、折光性较弱且呈圆形或椭圆形(图1B ↑和1C)。加入分化培养液继续培养，OPCs分化成未成熟(图1D↑)或成熟OLs(图1E↑)时，细胞突起数量明显增加，突起变长且有分支，分支常交互形成“蜘蛛网”样，极为茂密。

2.2 细胞免疫荧光染色

NG2 是OPCs的特异性标志蛋白，而MBP是成熟OLs 特异性标志蛋白[17]。分别使用这两种蛋白的抗体对纯化后的OPCs及分化后的OLs进行免疫荧光染色，再使用携带Cy3 的荧光二抗标记，DAPI 染核。结果显示阳性细胞发红色荧光，细胞核被染为蓝色(图2，图3)。

对OPCs进行NG2特异性抗体免疫荧光染色,结果显示大部分细胞为NG2 阳性的OPCs(图2)，形态为两极或三极突起状，还存在少量NG2阴性的杂细胞。

A： 10 倍, B： 20 倍图 2 树鼩OPCs 的NG2 免疫荧光染色Figure 2 Immunofluorescence staining of NG2 of tree shrew OPCs

对OLs 进行MBP特异性抗体免疫荧光染色，结果显示一部分细胞为MBP阳性的OLs(图3)，形态为“蜘蛛网”样的突起，但也存在较多的MBP阴性的杂细胞。

2.3 OPCs 生长曲线

在PDL 处理过6 孔板中，OPCs 可以在2 h内全部贴壁，OPCs 从两极开始伸出突起，在12 h 内细胞增殖相对较慢，而在之后的时间里，出现明显扩增，而且呈现OPCs 的典型形态。在12～60 h，细胞增殖明显，在此之间，细胞进入对数生长期。72 h 后，细胞增殖变缓，细胞数量逐渐减少，细胞开始不再增多而进入分裂终期。根据每日测得的A490，取平均值作生长曲线(图4)。

图 4 树鼩OPCs 生长曲线Figure 4 The growth curve of oligodendrocyte progenitor cell

3 讨论

在CNS疾病或者损伤时，不仅可以导致损伤中心附近区域神经元大量死亡，同时还能导致OLs 坏死和凋亡，最终导致轴突脱髓鞘化以及神经功能恢复困难。移植OLs并不能有效形成髓鞘,再加上对髓鞘发育/再生过程中的分子机制还没有完全了解，导致这类疾病迄今还没有有效治疗方法。OPCs 是CNS 中一类干细胞样的细胞[15]，它可以不断增殖，并且最终可分化为OLs、2 型星形胶质细胞以及神经元[16]。因此有研究者[10]猜测OPCs 可能是治疗CNS 疾病或者损伤的理想细胞。树鼩大脑较发达，且比大鼠、小鼠更接近灵长类动物，是研究神经系统疾病较为理想的实验动物。分离培养高纯度、高质量的树鼩OPCs是开展相关神经系统疾病研究的基础。

本实验借鉴差速贴壁法以及传统的恒温摇床分离法[9,14,15]和化学分离法[13]来纯化体外培养的OPCs。OPCs 主要存在于大脑皮层，但从大脑皮层获取的原代细胞种类中，不仅有OPCs，还有大量的星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、成纤维细胞、血管内皮细胞以及尚不清楚的杂细胞[9]，因此，去除以上细胞污染、获得纯化的OPCs 是本实验的关键。本试验采用出生48 h 内树鼩，优点之一是此时树鼩的脑部还没有进一步分化发育，所含的OPCs 大部分还处于增殖阶段，细胞活性高，易于体外培养[9]；其次，其脑膜易于剥离，能有效去除原代培养中成纤维细胞和血管内皮细胞污染。去除脑膜、脑干等组织后的大脑皮层，使用胰酶和DNase I 联合消化来获得细胞悬液。通过对比单独采用胰酶或胰酶和DNase I 联合使用，表明两者联合使用，能降低细胞悬液的粘稠度，并能更好形成单细胞悬液。

利用OPCs 贴壁速度明显慢于其他细胞的特点，对原代细胞进行多次差速贴壁处理，可有效降低杂细胞污染，例如，成纤维细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞等。在混合培养5 d 后，可更换培养液，加入增殖培养液。增殖培养液中低浓度血清以及细胞因子，不仅能抑制其他杂细胞生长，还可以促进OPCs 增殖。

首次分离纯化时，通过对比两种不同分离方法，可清晰地发现化学分离法要优于恒温摇床分离法。通过化学分离法纯化，可以减少对OPCs机械损伤，尤其是对OPCs 突触的损伤，大大提高了细胞活性，OPCs 的存活率可达到95%。其次，大大缩短分离时间, 简化了纯化步骤，一般恒温摇床分离需要20 h左右, 而化学分离只需孵育20 min。但化学分离法也存在缺点，孵育后需要用枪头吸取培养液，轻轻吹打细胞面，这能让OPCs 充分地分离，但也导致一些杂细胞被吹打下来，影响了OPCs 的纯度。

因此，对于首次分离纯化的混合细胞，需再次采用两次差速贴壁法进一步纯化OPCs。首先，最先纯化的细胞，经过离心稀释成细胞悬液，在未被PDL处理过的培养瓶或培养板里孵育1 h，能有效除去较大和易贴壁细胞。其次，取上清细胞悬液接种于PDL处理过的培养瓶或培养板中再孵育1 min，能进一步除去较难贴壁的杂细胞，但同时也会损失部分OPCs。最后，将纯化后细胞悬液接种于PDL处理过的培养瓶或培养板培养。纯化时，全过程都使用混合培养液，其中的高浓度血清能减弱对OPCs 的损伤，提高细胞活性。纯化后继续培养，OPCs 能在2 h 内完全贴壁，再换培养液进行增殖或分化培养。

在原代未纯化细胞中, 可以清晰观察到OPCs形态主要以两极或三极的突起为主，胞体较小且折光性强。经过纯化和分化培养后，观察到OPCs 突起增多, 并且相互连接成“蜘蛛网”状,胞体无明显变化, 与文献[3-9,14-16]的实验报道相似(图1C～1E)。

OPCs 增殖、分化和髓鞘形成过程受到细胞内部性质、细胞生存周期和其他细胞分泌(神经元、间充质干细胞、神经胶质细胞、心肌细胞等)信号分子等因素的影响[3]。在OPCs 增殖、分化等培养液中加入相应的物质和细胞因子, 可促进其增殖、分化。有研究表明, PDGF-aa 和bFGF联合使用[3]、巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)[15]和15% B104 条件培养基[14]具有促进OPC 增殖效应。分化培养时，OPCs 缺少增殖能力，而无法除去的杂细胞也开始增殖，再加上OPCs 还能分化成2 型星形胶质细胞，OLs 其纯度开始下降，这是定向分化的最大问题。有研究证明，分化液中人睫状神经细胞营养因子(CNTF)，不仅可诱导OPCs 分化成少突胶质细胞，也能诱导OPCs 分化成2 型星形胶质细胞[18]。因此建议，先让细胞分化4 d，之后再加入CNTF 来提高细胞存活率，也可以限制OPCs 分化方向。而对于一些较难除去的杂细胞，只能增加差速贴壁时间，或者添加能抑制其增长的细胞因子。

综上所述，本实验采用化学分离法和差速贴壁法来分离纯化OPCs，并对分离后细胞再进行二次差速贴壁纯化，能获得活性高且纯度高达97%的OPCs，且较其他方法如恒温摇床法、抗体免疫筛选法[17]简便、可靠、易于推广。本研究为树鼩OPCs体外分离培养进行了实验性探索，也为今后开展树鼩CNS 疾病模型奠定了基础。