正交实验优选荆丹子巴布剂提取工艺研究

韩润，唐英，姚譞（通讯作者）

（1.上海张江中药制药工程技术研究中心，上海 201203；2.上海中药制药技术有限公司，上海 201203）

0 引言

荆丹子巴布剂由紫荆皮，黄荆子，牡丹皮等9味中药组成，是在石氏伤科著名的外用药三色敷的基础上优化而来的，源于国医大师石仰山先生多年临床试验的经验方，已在临床上应用长达30年之久，用于风湿、类风湿性关节炎，痛风引起的关节红、肿、热、痛，活动受限等，疗效确切，未见不良反应[1-3]。传统方法以水提工艺路线提取后制成外用巴布剂，考虑到处方中的挥发性及其他脂溶性成分在传统工艺中不能充分提取，我们在此基础上以芍药苷和总黄酮的含量为指标对工艺进行优化[4-7]。首先，我们考察了不同提取溶剂对处方中有效成分的影响；其次，以正交试验考察了煎煮次数、煎煮时间和加溶剂量优先最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫荆皮、黄荆子、栀子、牡丹皮、大黄、赤芍、独活、五加皮、天南星（均购自上海上药华宇药业有限公司）。乙醇、甲醇（分析纯，国药）；甲醇（色谱纯，Mer ck）Agil ent 1260高效液相色谱仪（美国）；电子天平(BT224S赛多利斯)；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；AS20500BDT 超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；实验室纯水系统(mil l ipor e)。

1.2 芍药苷含量测定

（1）色谱条件。ODS-3 C18色谱柱（250 mm 4.6 mm，5 μm），甲醇：水（20:80）洗脱时间：20 min；流速：1 mL•min-1；柱温：30 ℃；检测波长230 nm。

（2）标准品及供试品制备。①供试品制备：取冻干浸膏中粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇溶液25 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率35 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。②标准品配制：取芍药苷标准品12.15 mg，精密称定，加甲醇制成浓度为每mL含0.486 mg的溶液。

（3）专属性试验。按照上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、样品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，结果见图1。试验结果表明，处方中其他杂质不干扰测定。

图1 HPLC专属性实验图谱

（4）标准曲线建立。取浓度为0.486、0.243、0.122、0.061、0.031 mg•mL-1的芍药苷对照品，分别进样10 μL分析，以对照品含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=13689X+25.65，相关系数r=0.9999，在0.031-0.486 mg•mL-1范围内线性关系良好。

（5）稳定性试验。取供试品溶液在（1）所述的色谱条件下，于0, 2,4,8,12,24 h进样并测定峰面积，RSD=0.37%，说明样品稳定性良好。

（6）精密度试验。将芍药苷标准品溶液分为高、中、低三个浓度，同日连续进样6次的RSD分别为0.16，0.17，0.28%，表明日内精密度良好；隔天进样，连续3 天的RSD为0.58，0.64，0.72%，表明日间精密度良好。

（7）重复性试验。按（2）方法制备供试品溶液6份，以0.45 μm微孔滤膜过滤后进样10 μL分析， RSD=0.94%。

（8）回收率试验取。已知含量的供试品，精密加入芍药苷对照品，按样品测定方法制备供试液，测得平均回收率为102.4%，RSD=1.53%(n=6)，回收率均符合相关规定。

（9）样品含量测定。称取用水、50%醇、65%醇、80%醇提取的冻干浸膏以及正交试验中冻干浸膏中粉约0.5 g，按供试品制备方法制备并进样分析，测定浸膏中芍药苷的含量。

1.3 总黄酮含量测定

（1）标准品及供试品配制：①供试品配制：取冻干浸膏中粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率35 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。②标准品配制：称取芦丁标准品15.36 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，稀释至1.536、0.768、0.384、0.192、0.096 mg•mL-1备用。

（2）标准品及供试品处理方法。取供试品、芦丁对照品1 mL加0.1 mol•L-1三氯化铝显色剂溶液2 mL，再加1 mol•L-1醋酸钠溶液4 mL至于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。于65 ℃水浴显色25 min，在510 nm波长处测定吸光度。[8-10]

（3）标准曲线建立。取浓度为1.536、0.768、0.384、0.192、0.096 mg•mL-1的芦丁对照品按（2）项下方法显色后在510 nm波长处测定吸光度，以对照品含量为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=2.286X-0.004，相关系数r=0.9999，在0.096-1.536 mg•mL-1范围内线性关系良好。

（4）样品含量测定。称取用水、50%醇、65%醇、80%醇提取的干浸膏0.2 g，按供试品配制方法制备后按1.3.2项下方法处理后分析，测定干浸膏中总黄酮的含量。

1.4 提取工艺研究

传统荆丹子伤膏为水提液，以传统工艺为基础对比考察水、50%醇、65%醇、80%醇不同提取路线对药效及指标含量的影响。而后进一步进行正交工艺优化。

（1）提取路线选择。按处方平均投料4份，加溶剂煎煮2次，每次10倍溶剂、煎煮1 h，第一次煎煮前浸泡0.5 h，每次煎煮后300目滤布滤过，二次煎液合并，减压浓缩密度1.1后得浸膏，提取溶剂分别为水、50%醇、65%醇、80%醇。以总黄酮（芦丁计）和芍药苷转移率为指标，选择最佳提取路线。

（2）提取工艺正交试验。按正交试验表L9(34)(n=3)，考察对煎煮工艺主要影响因素的水用量、煎煮时间、煎煮次数对煎煮效果的影响，正交试验因素水平见表2，以总黄酮含量，芍药苷转移率，出膏为评价指标，含量及转移率评分标准为di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)；出膏评分标准为di=(Ymax-Ymin)/(Ymax-Ymin)。含量及转移率以各占40%的权重设置总评分，出膏占20%的权重设置总评分。

2 结果

2.1 提取路线的选择结果

提取路线的选择结果见表1，随着溶剂极性的减小，出膏降低，芍药苷含量增加，转移率在50%醇提路线中最高，总黄酮同在50%醇提方案中达到最高值。综合考察以处方中总黄酮含量，芍药苷转移率为评价指标。最终以50%醇作为溶剂进一步研究。

表1 不同提取路线下的出膏率、芍药苷、总黄酮

2.2 提取工艺正交试验结果

提取工艺正交试验结果见表2，表3，表4使用SPSS 21.0处理数据。正交结果显示：以A3B2C3提取为最佳工艺。根据K值分析，以加溶剂量12倍对处方的提取效果最好；提取时间为1.5 h和2 h时提取效率均较好，且无显著性差异，参考主效应的方差分析表，认为效应之间排序为提取次数＞提取倍数＞提取时间。考虑到处方中有挥发油性药材和煎煮成本，选择B2为提取时间；提取次数为C2最佳。因此，最终我们采用A3B2C2路线为处方的提取工艺。

表2 正交试验水平因素表

表3 L9（34）正交试验及结果

2.3 工艺验证实验

按处方准确称取185 g，共三份。按照选定的条件A3B2C2重复测定3次，结果见表5.三次实验结果RSD均低于3%，证明该工艺稳定性重复性良好，可行。

表4 DL（%）的主体间效应的检验

表5 验证实验结果（%）

3 结论

中药外治法，其历史悠久、痛苦少、疗效确切以及费用低而被临床广泛运用。膝骨性关节炎属于中医“骨痹”、“膝痹”范畴。中医中药治疗该病有独特优势，中药可改善局部微循环、降低骨内压、抗氧化和抑制自由基的产生、降低骨性关节炎细胞因子的产生等等[11]。本处方中君药为紫荆皮和赤芍，芍药苷在抗炎镇痛方面具有良好的效果,同时还可以调控β-ar r est in2的表达，抑制FLS过渡增殖，调节c AMP趋于正常水平，从而抑制滑骨膜细胞的异常增殖，可能成为治疗膝骨性关节炎的机制之一[12-13]。同时芍药苷也是2015年版《中国药典》中赤芍项下规定含测指标。紫荆皮抗炎类成分主要为黄酮类，大量试验证明黄酮类化合物具有显著的抗炎效果，其抗炎机制主要是影响炎症因子和前炎症因子的产生和释放以及细胞间的相互作用[14-15]。另外处方中黄荆子以及天南星均含有大量黄酮类活性成分[16-17]。故本研究以芍药苷转移率，总黄酮含量、出膏率为评价指标，以保证浸膏的制备质量[18]。研究结果表明，以50%醇提的路线药效结果最佳，同时总黄酮含量和芍药苷转移率最高。以最佳提取路线进行工艺研究，结合实际生产成本，确定了最佳提取工艺为12 倍量水，煎煮提取2 次，每次1.5 h。经过三批小试工艺验证，RSD均低于3%，证明该工艺稳定可行。本课题开发的荆丹子巴布剂制备，提高了该制剂的质量，减少刺激性，增加患者适应性，为药品生产与推广提供了依据和保证，具有重要意义。