粪肠球菌分子分型特点及其与泰利霉素敏感性的关系

黄 震，胥志超，张 波，王红燕，陈 重，白 冰，潘伟光，李桂秋，徐广健，余治健，邓启文，李多云

(1. 深圳大学医学院附属南山医院感染科及内源性感染诊治研究重点实验室，广东 深圳 518052； 2. 深圳市宝安区人民医院肺科门诊,广东 深圳 518101； 3. 深圳市医院感染质量控制中心，广东 深圳 518052)

粪肠球菌是肠球菌最常见的菌种，作为一种条件致病菌可引起泌尿道感染、伤口感染、腹腔内感染、感染性心内膜炎及血流感染等[1]，其耐药机制复杂且可水平传播，给医院感染控制工作带来挑战。粪肠球菌对大环内酯-林可酰胺-链阳霉素B (MLSB)耐药比较普遍[2-3]，此与甲基化酶改变23S rRNA上的V区药物作用靶位(A2058)有关，而最常见的甲基化酶基因为ermB[4-5]。泰利霉素作为酮内酯类抗生素的代表性药物，是首个获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准进入临床应用的酮内酯类抗生素[6]，较MLSB多一个作用位点(II区A752)，其与rRNA结合更牢固，从而抵消部分甲基化酶的作用[7]。目前，国内暂未发现泰利霉素用于抗临床分离粪肠球菌研究的相关报道。多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)技术是用于分析细菌系统性进化同源性的重要工具，不同地区分布的优势ST型不同，其耐药特性也不同[8]。本研究采用MLST分析粪肠球菌同源性情况，探讨不同基因分型的粪肠球菌中ermB基因分布情况及对泰利霉素敏感性的差异，为控制其医院传播提供实验室依据。

1 对象与方法

1.1 菌株及来源 320株粪肠球菌分离自深圳市南山医院2010—2016年住院患者临床标本，标本来源为尿139株(43.4%)，创口分泌物57株(17.8%)，血32株(10.0%)，胆汁27株(8.4%)，其他部位(胸腔积液、腹腔积液、脓液、痰、渗出液、组织块、引流液、羊水、导管等)共65株(20.3%)。

1.2 菌株鉴定和药敏试验 所有菌株经VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国梅里埃公司)鉴定，采用2016年美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测定所有药物最低抑菌浓度(MIC)值，主要药物包括红霉素、泰利霉素、氨苄西林、万古霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、多西环素和利福平，以粪肠球菌ATCC 29212作为质控菌株。泰利霉素的折点参考2016年CLSI推荐对金黄色葡萄球菌折点：敏感(≤1 μg/mL)，中介(2 μg/mL)，耐药(≥4 μg/mL )。

1.3 基因组DNA提取与纯化 采用DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取试剂盒按照革兰阳性菌操作流程提取细菌基因组DNA，提取的DNA -20 ℃保存备用。

1.4 耐药基因ermB检测 耐药基因ermB引物：erm(B)-F：CCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGC；erm(B)-R：GAATCGAGACTTGAG-TGTGC，由北京六合华大基因公司合成。ermB基因PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min，PCR产物(359 bp)于4 ℃保存。产物随机提取纯化后测序，比对后确定为目的基因。

1.5 MLST PCR扩增粪肠球菌7对管家基因(gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yiqL)，其引物、反应体系及反应条件参照MLST网站(http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp)，PCR产物纯化后进行测序，测序结果提交MLST网站(http://mlst.net)比对，与数据库中的粪肠球菌相应基因的等位基因进行比较，最终确定粪肠球菌分离株的ST型。

1.6 统计学分析 应用统计软件SAS 9.45进行分析，所有耐药率数据精确到小数点后一位，统计学处理中耐药率的比较采用χ2检验及Fisher确切概率法，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 粪肠球菌的耐药率 粪肠球菌对泰利霉素中介26株，耐药138株，耐药率达51.3%，对红霉素耐药率高达95.6%，二者差异有统计学意义(χ2=161.92，P<0.001)。见表1。对利奈唑胺、万古霉素、呋喃妥因、氨苄西林耐药率分别为15.6%、0.6%、2.2%、0.6%，对多西环素、利福平及环丙沙星耐药率分别为85.9%、95.3%和38.4%。

2.2 MLST及ermB基因的分布 320株粪肠球菌中，207株(64.7%)ermB基因阳性，分为48个ST型，56株菌属于MLST数据库中未记载的新ST分型(NT)，优势菌株为ST16、ST179和ST30。ST16型 85株(26.6%)，其中72株(84.7%)ermB阳性，对泰利霉素敏感29株(34.1%)，耐药56株(65.9%)；ST179型80株，其中71株ermB阳性，对泰利霉素敏感15株(18.8%)，耐药65株(81.3%)；ST30型13株(4.1%)，其中8株ermB阳性，对泰利霉素敏感11株(84.6%)，耐药2株(15.4%)；其余ST型142株，56株携带ermB基因，对泰利霉素耐药41株(28.9%)。不同MLST粪肠球菌对红霉素及泰利霉素的MIC值及ermB基因携带情况见表2。

表1320株粪肠球菌对泰利霉素及红霉素的药敏结果 (株)

Table1Antimicrobial susceptibility of 320 strains ofE.faecalisto telithromycin and erythromycin(No.of isolates)

抗菌药物SIR泰利霉素15626138红霉素1456250

S:敏感 I：中介 R：耐药

表2 不同MLST粪肠球菌对红霉素及泰利霉素的MIC值及ermB基因携带情况

红霉素折点：S≤0.5 μg/mL，I 1～4 μg/mL，R≥8 μg/mL;泰利霉素折点: S≤1 μg/mL，I 2 μg/mL，R≥4 μg/mL

2.3 不同MLST及是否携带ermB基因粪肠球菌对红霉素及泰利霉素的药敏结果 比较优势亚型ST16、ST179和ST30型及其他ST型别粪肠球菌对红霉素及泰利霉素的药敏结果，经χ2检验发现，不同ST亚型粪肠球菌对红霉素及泰利霉素的药敏结果差异均有统计学意义(P<0.001)，见表3。ermB阳性的粪肠球菌对红霉素与泰利霉素的敏感率均低于ermB阴性组(均P<0.001)，见表4。

表3 不同MLST粪肠球菌对红霉素及泰利霉素的药敏结果比较

表4 是否携带ermB基因粪肠球菌对红霉素及泰利霉素的药敏结果比较

3 讨论

粪肠球菌是人类肠道常见的共生菌，也是导致各种医院感染常见的病原体。粪肠球菌对多种抗菌药物天然耐药，且可通过转座子等获得耐药基因，使耐药属性在细菌间水平传播，给临床治疗带来巨大挑战[9]。随着大环内酯药物在临床上的广泛使用，肠球菌属对大环内酯类抗生素耐药较严重[9]。世界范围内已有多项研究将酮内酯泰利霉素用于治疗粪肠球菌感染，其效果均优于第一、二代大环内酯类药物[10-11]。本研究结果显示，粪肠球菌对泰利霉素总耐药率达51.3%，高于文献[10-11]研究，但低于对红霉素的耐药率(泰利霉素对粪肠球菌的抗菌效果优于红霉素)。本研究发现粪肠球菌对常用抗阳性球菌药物万古霉素、呋喃妥因、氨苄西林均保持高敏感性，但对利奈唑胺的耐药性高达15.6%，高于其他研究[12]报道；同时，粪肠球菌对多西环素、利福平均保持高耐药性。故临床上粪肠球菌感染应多选用氨苄西林、万古霉素、呋喃妥因或利奈唑胺。

采用MLST分析发现，该院粪肠球菌可分为48个ST型和56株MLST数据库未登记的ST型(NT)，ST16和ST179为绝对优势菌群，其同属CC16克隆复合群(Clonal complex)，其次为ST30、ST28及ST11等。ST16和ST179较其他ST型对泰利霉素的敏感性亦较差，耐药率分别达65.9%、81.3%。检测耐药基因ermB，发现在ST16和

ST179型粪肠球菌中ermB基因的阳性率较高，分别为84.7%、88.8%，耐药基因ermB的存在对降低泰利霉素的敏感性起重要作用。

目前，国内外已有多个报道对临床及环境分离的粪肠球菌MLST及特征进行研究。李岩等[13]在辽宁某医院分离的优势菌群亦为ST16、ST179，且其毒力基因cylA、gelE、esp和asa1携带率在70%以上。研究[14-15]表明，ST16还具有更容易形成强生物膜和更高的特地唑胺(tedizolid)耐药率等特性。国外粪肠球菌MLST相关研究亦显示CC2、 CC16、CC21、CC30、CC40及 CC87是世界范围内播散的优势菌株[16]，上述克隆群在本院亦有发现，而Ruiz-Garbajosa等研究[17]更是将ST16描述为“适应医院的菌群之一”，意味着ST16更容易产生多重耐药。该院粪肠球菌以ST16和ST179为主，且标本来源以尿、创口分泌物为主，尿路的侵入性操作或导管的使用增加、无菌意识薄弱、伤口处理不当均有导致其流行的可能，在临床治疗中也应根据CC16的特点合理选用抗菌药物。

粪肠球菌的耐药机制复杂，本研究仍存在局限性。erm基因有数十种亚型，粪肠球菌主要携带ermB基因，本研究仅对ermB基因携带情况进行研究，亦不排除其他erm基因同时存在并引起泰利霉素耐药的可能。本院MLST以ST16及ST179分型为主，ermB的高携带率仅是红霉素、泰利霉素高耐药率机制之一，其他机制仍有待进一步研究。