海南地区疑似肺结核患者非结核分枝杆菌感染特征

钟业腾, 林明冠, 林 翀, 陈灼霖, 郑文鑫, 裴 华

(海南医学院第二附属医院 1. 检验科； 2. 放射科，海南 海口 570311)

非结核分枝杆菌(non-tuberculous Mycobacteria， NTM)是除了结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌)与麻风分枝杆菌外的一类抗酸染色阳性分枝杆菌的统称，大部分为非致病菌[1-2]，至今已发现170余种，同时不断发现新的菌种，广泛存在于自然环境中。根据NTM的生长速度，可划分为快生长分枝杆菌(rapidly growing mycobacteria， RGM)和慢生长分枝杆菌(slowly growing mycobacteria， SGM)两种类型。NTM可以侵袭肺部、皮肤及骨髓等部位，其中最常见的是侵袭肺部引起肺部感染[3]，NTM肺部感染好发于有基础肺部疾病的患者[4]，其与肺结核在临床上难以单纯地依靠临床症状及影像学表现等特征加以鉴别，当患者痰抗酸杆菌涂片为阳性，而未进行分枝杆菌培养及鉴定，且又具有肺结核临床相关症状及影像学表现时，临床上极易误诊为结核病[5-7]，但NTM感染与结核病的治疗方案明显不同，这给临床诊疗及防控带来极大的挑战。因此，NTM已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题，引起了社会广泛关注[8-9]。近年来，国内外部分地区相继报道了当地的NTM分离率、菌种构成分布及耐药性等情况，不同国家和地区存在差异[10-11]。海南地区地处亚热带沿海区，有独特地理环境，但是海南地区有关NTM菌种分布、耐药性及临床特点等研究鲜见。为了解海南地区疑似肺结核患者的NTM菌种分布、耐药性及临床特点等情况，本研究通过收集海南医学院第二附属医院(即海南省结核病医院，是海南省耐多药结核病唯一诊疗医院)疑似肺结核患者的痰、肺泡灌洗液等呼吸道标本进行分离培养鉴定及药敏分析，以此了解NTM菌株的构成分布及耐药等情况，同时对NTM肺部感染患者的临床资料进行分析，为本地区NTM肺部感染的预防及诊治提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料收集 收集2015年1月—2018年8月于海南医学院第二附属医院就诊的疑似肺结核患者痰、肺泡灌洗液等呼吸道标本NTM分离情况及临床资料。同一患者多次培养的NTM，只记录研究期间第一次培养检出的菌株。因临床资料不全，无法鉴定菌种或无药敏结果的疑似肺结核患者不纳入研究。依据国家卫生和计划生育委员会颁发的《肺结核诊断》(WS 288—2017)判断疑似肺结核病例[12]。

1.2 仪器与试剂 仪器：洗干仪、杂交仪、核酸快速提取仪和微阵列芯片扫描仪为北京博奥公司生产，基因扩增仪为杭州博日科技有限公司生产，BSC-1600ⅡB2型生物安全柜为苏州安泰公司生产，恒温培养箱为上海博迅公司生产。试剂：酸性、药敏及鉴定罗氏培养基和抗酸杆菌染色液为珠海贝索公司生产，分枝杆菌菌种鉴定试剂盒及耐药基因检测试剂盒为北京博奥公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 抗酸杆菌涂片、分枝杆菌培养及菌型鉴定 严格按照《结核病实验室检验规程》[13]操作要求，分别采用萋尼染色法(冷染)进行涂片并镜检，改良罗氏培养法对疑似肺结核患者痰、肺泡灌洗液等呼吸道标本进行分离培养，利用PNB及TCH鉴定培养基进行初步区分结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)和NTM。

1.3.2 NTM菌种鉴定 采用基因芯片法对结核分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、偶然分枝杆菌、土分枝杆菌、浅黄分枝杆菌、龟/脓肿分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、金色分枝杆菌、海/溃疡分枝杆菌、苏尔加/玛尔摩分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌等临床上常见17种分枝杆菌菌种进行鉴定。其检测原理是采用固化于支持物表面的DNA探针与标记的标本进行杂交，通过检测杂交信号可快速、高通量地检测标本中的核酸，从而鉴定出NTM菌种类型。标准菌株为由国家疾病控制与预防中心(CDC)结核病参比实验室提供的H37Rv标准敏感株。

1.3.3 药敏试验 采用比例法药敏试验对分离菌株进行8种常用抗结核药物的敏感试验，药敏培养基药物浓度分别为异烟肼(INH)0.2 μg/mL、利福平(RFP)40 μg/mL、链霉素(SM)4 μg/mL、乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL、卡那霉素(KM)30 μg/mL、氧氟沙星(OFX)2 μg/mL、丙硫异烟胺(PTH)40 μg/mL 和卷曲霉素(CPM)40 μg/mL。

1.3.4 质量控制 根据质量控制要求[13]，痰标本分枝杆菌分离培养的涂阳培阴率(涂阳培阴率=培养阴性的标本数/涂片阳性的标本数×100%)应<10%，污染率(污染率=污染的培养管数量/培养管总数×100%)应<5%。比例法药敏试验的高稀释度菌液在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落，应重复试验。每年参加国家抗结核药敏试验熟练度考核及结核病分子诊断技术能力验证。

2 结果

2.1 分离培养及菌种分类情况 2015年1月—2018年8月临床共收集2 965份痰或肺泡灌洗液等呼吸道标本进行分枝杆菌分离培养，培养阳性率为35.0%(1 038/2 965)，其中涂阳培阴率为9.6%(66/689)，污染率为4.3%(255/5 930)，符合痰培养质量控制要求。经PNB及TCH鉴定，862份标本检出MTB，占83.0%；182份标本检出NTM，占17.5%；其中有6份标本同时检出MTB和NTM。剔除重复病例和菌株，在筛选出的833份培养阳性标本中，712份标本检出MTB，占85.5%；126份标本检出NTM，占15.1%；其中有5份标本同时培养出MTB和NTM。126份初步鉴定为NTM的标本，最终经菌种鉴定发现MTB占2.4%(3株)，非分枝杆菌属细菌(1株仁川冢村氏菌，2株支气管戈登氏菌)占2.4%。最终鉴定共有120份标本检出NTM。

2.2 NTM感染类型分布 120份经菌种鉴定为NTM的标本中，无法鉴定至种NTM占3.3%(4株)，最终116份标本中检出118株NTM。单一NTM感染109例，占94.0%。其中快生长型分枝杆菌感染占45.9%(50例)，主要是以龟/脓分枝杆菌感染为主，占43.1%(47例)；慢生长型分枝杆菌感染占54.1%(59例)，主要是以胞内分枝杆菌感染为主，占37.6%(41例)。7例患者(6.0%)标本中检出两种分枝杆菌，分为鸟分枝杆菌+胞内分枝杆菌、MTB+龟/脓分枝杆菌、MTB+胞内分枝杆菌、MTB+戈登分枝杆菌、MTB+偶然分枝杆菌5种混合感染。见表1。

2.3 NTM对抗结核药物的耐药情况 118株NTM药敏试验结果显示，8种NTM对8种一、二线抗结核药物呈不同程度的耐药，对8种药物的总耐药率由高至低依次为：INH 96.6%、SM 92.4%、RFP 90.7%、OFX 90.7%、CPM 89.8%、KM 86.4%、EMB 62.7%、PTH 33.9%。见表2。耐6种及以上抗结核药物的比率高达86.4%，其中对8种药物全部耐药比率达32.2%，耐5种以下仅占11.0%，快生长型NTM中对8种药物全部耐药的比率达69.8%。见表3。

表1 NTM感染类型分布情况

注：龟/脓肿分枝杆菌与偶然分枝杆菌为快生长型分枝杆菌；检出的其他6种NTM菌株为慢生长型分枝杆菌

表2 118株NTM对8种抗结核药物的耐药率[%(株)]

表3 118株NTM对抗结核药物的耐药类型分布[%(株)]

2.4 NTM感染病例临床资料 120例NTM肺部感染患者，参照纳入和排除标准，剔除4例无法鉴定NTM菌种和8例临床资料不全的病例，共有108例NTM肺部感染患者纳入完整临床资料分析(包括临床表现及影像学资料等)。

2.4.1 一般资料 108例NTM肺部感染患者平均年龄为(60.6±14.2)岁，其中男性43例(39.8%)，年龄为(62.7±17.0)岁，女性65例(60.2%)，年龄为(59.3±11.9)岁，男女比例为0.66∶1。主要好发于中老年人，其中>50岁的患者有85例(78.7%)，见图1。有88例(81.5%)来自农村或农场主要从事体力劳动的农民或工人。患者主要以海南省沿海地区为主，中部地区相对少见，沿海的海口多达22例，东方14例，文昌12例，万宁11例，澄迈10例，临高9例，见图2。

图1 108例NTM感染患者的年龄分布

图2 108例NTM感染患者来源地区分布

Figure2Area distribution of 108 patients with NTM infection

2.4.2 临床特征 108例NTM肺部感染患者均有明显的呼吸系统临床症状，具体表现为咳嗽咳痰100例(92.6%)、盗汗7例(6.5%)、胸闷气促35例(32.4%)、血痰或咯血31例(28.7%)、乏力7例(6.5%)、发热18例(16.7%)、食欲减退47例(43.5%)、体重下降50例(46.3%)。

108例NTM肺部感染患者中患基础疾病的情况：有结核病史84例(77.8%)、支气管扩张22例(20.4%)、肺部感染45例(41.7%)、咯血21例(19.4%)、社区获得性肺炎7例(6.5%)、慢性阻塞性肺疾病10例(9.3%)、呼吸衰竭7例(6.5%)。

2.4.3 影像学特征 108例NTM肺部感染患者肺部CT检查结果：75例(69.4%)有继发型肺结核，53例(49.1%)有肺部空洞，98例(90.7%)双侧肺部均累及，70例(64.8%)双侧胸膜肥厚，57例(52.8%)有支气管扩张，19例(17.6%)伴有肺气肿，37例(34.3%)显示肺部感染影像。

3 讨论

NTM是一群能引起从轻微的自限性皮肤感染到危及生命的全身感染的分枝杆菌。由于人们对其致病性的认知尚有不足，曾被认为对人类无致病性或弱致病性，但目前已经发现多种与结核病临床症状类似的病程长、治疗困难的NTM感染。近年来，随着NTM临床实验室诊断水平不断提高，NTM感染引起的人类疾病呈上升趋势，已引起社会高度关注。我国五次结核病流行病学调查结果显示，NTM检出率从4.2%增加到22.9%，NTM的分离率呈逐年上升趋势[14]。虽然当前我国尚缺乏关于NTM全国性的大样本研究数据，但根据现有关于NTM流行研究数据显示，我国NTM感染分布具有气候温和地区高于寒冷地区，南方地区高于北方地区，沿海地区高于内地地区等特点[15]。本研究中，在海南地区833例疑似肺结核患者分枝杆菌培养阳性呼吸道标本中，最终120例患者标本分离出NTM，NTM检出率为14.4%，高于气候寒冷的甘肃(4.83%)[16]和福建(10.2%)[17]地区，符合我国NTN流行气候分布特征。

由于不同的NTM菌种引起疾病的治疗方案有所不同，而未知病原体极易造成疾病病情的迁延不愈和出现耐药，因此，准确快速的鉴定分枝杆菌菌种对临床诊疗及流行病防控有重要意义。本研究主要采用基因芯片法对PNB/TCH鉴定为NTM的126株菌株进行检测发现，其中3株为MTB，3株为非分枝杆菌属细菌，提示在PNB/TCH鉴定时应结合分子诊断学技术进行NTM菌种鉴定，防止耐PNB的MTB及非分枝杆菌属细菌对PNB/TCH鉴定结果造成误差。3株非分枝杆菌属细菌外送检验进行16S rRNA鉴定，1株为仁川冢村氏菌，另2株为支气管戈登氏菌，均属于放线菌，抗酸染色弱阳性，在罗氏培养基上生长及形态特点与分枝杆菌属极为相似，基因芯片法鉴定无法检测到相关检测信号，而其感染引发的肺部感染与NTM肺部感染临床症状极为相似，容易误诊误治。

在不同的国家和地区，NTM感染菌种构成也存在差异。美国主要为鸟胞分枝杆菌复合群，英国的威尔士及英格兰以堪萨斯分枝杆菌为主，而苏格兰则主要为玛尔摩分枝杆菌[15]。韩国以鸟胞分枝杆菌复合群和龟/脓肿分枝杆菌复合群多见，我国福建和山东地区以鸟胞分枝杆菌复合群为主，北京地区以鸟胞分枝杆菌复合群和堪萨斯分枝杆菌为主，而上海、广州地区则是以龟/脓肿分枝杆菌复合群为主[18]。本研究发现海南地区NTM感染患者中有109例患者为单一NTM感染，7例患者为两种分枝杆菌混合感染，共鉴定出8种NTM菌种和5种混合感染模式，7例混合感染患者的NTM均在单一感染NTM菌种范围内，但也发现有5例患者是MTB+NTM混合感染模式，提示临床应注意这类患者，应尽可能进行菌株分纯再进行药敏试验，减少误诊漏诊，尤其把敏感MTB误诊为MDR-TB。海南地区疑似肺结核患者中NTM感染最常见菌种为快生长型的龟/脓分枝杆菌，占43.1%，高于台湾[19]和杭州[18]地区，可能是由于脓肿分枝杆菌复合群常与潮湿和高温环境有关[20]，NTM菌种分布具有明显的地域差异与气候多样性特征，因此，导致脓肿分枝杆菌复合群在我国南方的流行率较高。其次NTM菌种是胞内分枝杆菌，占37.6%%，低于北京[21]和杭州[18]地区，可能与胞内分枝杆菌在自然环境中的广泛分布有关，尤其是在饮用水中。

NTM通常对常用抗结核药物有很高耐药率，本研究中118株NTM对一线抗结核药的INH、RFP、SM和二线抗结核药的OFX、KM、CPM的耐药率均高达85%以上，仅对PTH的耐药率低于35%，对8种抗结核药物全部耐药的比率高达32.2%，快生长分枝杆菌对8种药物全部耐药的比率高达69.8%，与文献[18]报道一致。海南地区是肺结核及耐药结核病高发区，临床医务人员在诊疗肺结核及耐多药肺结核病的过程中，应注意鉴别诊断肺结核和NTM肺部感染，并根据药敏结果选择多种抗结核药物联合用药以提高治疗效果。

NTM通常属于机会性致病菌，NTM的毒力和致病性均比MTB低，其易感因素主要是免疫力下降。本研究通过对108例NTM肺部感染患者一般资料分析显示：(1)NTM 感染好发于中老年患者，可能与随着年龄增大，人体免疫功能逐渐减退有关。(2)在海南地区，NTM感染者中女性多于男性，与台湾[11]、北京[21]及华东[3]等地区有所不同，但与美国女性患者感染率较高的情况相同[22-23]，可能与海南地区NTM肺部感染在不同的人群中有不同的机制和影响因素有关。(3)108例患者中有81.5%来自农村或农场从事体力劳动的农民或工人，而本研究中图2显示，海南地区NTM分布呈沿海平原地区高于中部多山地区，说明海南地区NTM肺部感染可能与患者的工作环境及生活条件有密切的联系，这也符合我国NTM流行的地理分布特征。

本研究发现，108例NTM肺部感染患者均以明显呼吸系统临床症状而就诊。其临床症状呈多样性，主要有咳嗽咳痰、胸闷气促、血痰或咯血、发热、食欲减退及体重下降等肺结核典型临床症状。临床基础疾病主要为支气管扩张、肺部感染、咯血等肺结核常见并发症。肺部CT主要显示肺部空洞、支气管扩张或伴有肺气肿和肺部感染等继发型肺结核的常见影像学表现。因此，根据这些研究结果，证实了单纯地依靠临床症状及肺部影像学表现难以将NTM肺部感染与肺结核进行鉴别，必须依靠病原学检查才能获得正确的诊断。而当前海南地区由于历史经济文化原因，该地区基层医院主要是依靠痰抗酸染色涂片、临床症状及肺部影像学表现诊断肺结核，可能会将NTM肺部感染患者误诊为肺结核，而本研究中108例NTM肺部感染患者主要也是因怀疑患有肺结核而就医，倘若此类患者未能及时培养鉴定出NTM，临床上一线抗结核药治疗未见好转，有可能会误诊为MDR-TB感染，因此，病原学检查是诊断NTM肺部感染的关键。

本研究不足之处：(1)选用基因芯片法进行菌种鉴定，因方法学限定无法深入分析少见NTM菌种；(2)由于部分门诊患者无法跟踪采集完整病例资料，导致本研究中部分患者未能纳入进行分析。这两点不足之处虽会影响本研究结果，但是本研究结果对海南地区NTM感染的防控、诊疗及今后进一步研究NTM感染提供了数据支持。