儿童结核性脑膜炎脑脊液蛋白质差异比较性研究

龚厚武 李玉飞＊

长沙医学院基础医学院 湖南长沙 410219

在全球范围内，结核性脑膜炎在肺结核中占有很大比例，其发病率和病死率均很高，尤其是在患儿和HIV 感染患者中[1]。而结核性脑膜炎(结脑)又是结核病的最严重类型，且儿童易感，但由于结脑早期临床表现特异性差，常被误诊为隐球菌性脑膜炎、化脓性脑膜炎、病毒性脑膜炎等疾病而延误治疗。其误诊率高达31.6～50%，而早期(一周内)诊断率仅为10%[2]。儿童结脑患者由于难以得到较多量的CSF，其结脑的诊断更为困难，使其预后更差。因此，寻找一种新的快速的诊断结核性脑膜炎的方法是目前临床上亟待解决的问题。

1 资料与方法

1.1 脑脊液收集

正常儿童CSF 标本来自外科需要腰麻的手术儿童，所有患儿均无神经系统受累表现，结脑患儿CSF 抗酸染色阳性，或者结核菌培养阳性。标本收集量：4ml。标本保存：所有标本加入蛋白酶抑制剂80µL（sigma），-70℃保存待检。

1.2 脑脊液样品制备

包括蛋白提取和蛋白定量。

1.3 双向凝胶电泳

分别取总蛋白质700μg 与水化液充分混合，使总体积达到450μl，在IPGphor 等电聚焦仪上进行等电聚焦，电泳条件为每胶2.5W 恒流电泳30min 后，改用每胶11W 恒流电泳至溴酚蓝离胶底缘约1mm 处停止电泳。

1.4 硝酸银染色

主要参照蛋白质银染试剂盒操作说明。将凝胶小心取下，固定液中过夜；敏化液中30min；蒸馏水洗涤3 次，每次5min；银染液中20min；蒸馏水洗涤2 次，每次1min；显影液中至刚好能看到所有的蛋白质斑点；终止液中10min；蒸馏水洗涤3 次，每次5min；保存液中至扫描。

1.5 图像分析

通过Imagescanner 扫描仪以及LabScan 扫描软件对凝胶进行扫描获取图像，借助图像分析软件PDQuest 7.0 进行详细分析，比较蛋白质斑点差异。以正常患儿CSF 的2-DE 凝胶为参考胶，将结脑患儿CSF 的凝胶与之进行比较。根据斑点的位置、大小、形状等参数，软件自动将不同图谱中的相同蛋白质点匹配。不能匹配的蛋白质斑点（升高或降低200%）视为差异点。

1.6 MALD-TOF-MS

将制备好的点样板置于Applied Biosystems Voyager System 4307 MALDI-TOF-MS 仪上进行分析，采用反射模式，正离子谱测定，离子源加速电压为20000V，反射电压比为1.12，N2 激光波长337nm，脉冲宽度为3 ns，离子延迟提取100ns，真空度4×10-7Torr，质谱信号单次扫描累加50 次，质谱使用胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，获取了肽质量指纹图。

1.7 Database 搜索

应用在线软件Mascot Distiller（http://www.matrixscience.com）进行搜索。鉴定结脑患儿CSF 中结核相关的特异性蛋白质分子。

1.8 Western Blot 固相化蛋白质免疫学检测证实

取50 ul 蛋白质样品，在变性聚丙烯酰胺凝胶中垂直板电泳。用水平电泳槽将凝胶进行电转移，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。柯达X 光胶片感光后自动洗片。VDS 图像分析系统进行显影条带分析。Western 印迹法可检测出1-5ng 的待检蛋白。

1.9 技术合成结核特异性蛋白质抗体，制备结脑特异性蛋白质诊断芯片。

2 结果

正常组与TM 组CSF 2-DE 图谱见图表1，实验中共选出个20 个差异蛋白质点进行分析，获得了20 张肽质量指纹图谱。软件识别其有效肽片断峰后查询数据库，搜索后匹配到蛋白质的点有16 个，其中有4 对蛋白质点为同一物质分别为2 号、25 号载脂蛋白A-I，4 号、5 号免疫球蛋白J 链，7 号、9 号免疫球蛋白γ 轻链VLJ 区，3 号、6 号单克隆免疫球蛋白M 冷凝素。

3 结论

对比结脑患儿和正常儿童的脑脊液蛋白质组图谱发现多处结核性脑膜炎特异性蛋白，诊断时使用结脑特异性蛋白质诊断芯片，通过分析脑脊液蛋白组图谱提高确诊结核性脑膜炎的速度和准确性可行。

4 讨论

TBM 是由TB 感染所导致发病的中枢神经系统感染性疾病，其由TB 透过血脑屏障引起软脑膜、蛛网膜和脑实质等的中枢神经系统的非化脓性炎症，为临床上常见的肺外结核病中的最严重类型[3]。患结核性脑膜炎，脑实质、脑血管、脊髓膜也常受累，多发生于儿童及青少年，TBM 临床多表现为发热、呕吐、抽搐、脑神经损害及昏迷等，临床上常采用脑脊液抗酸染色、结核菌培养、结核杆菌核酸扩增方法寻找病原学依据[4]。涂片仅能对含菌量大于10，00 个/ml 的标本表现出较高的敏感性而培养则需4-6 或8 周的时间，另外化疗所产生的培养时间的延长、低活力菌和型等非杆菌结构的生物学性状的改变更增加了培养的局限性[5]。

中枢神经系统疾病能够显著影响CSF 中蛋白质的浓度以及蛋白质存在的表达。大量的研究证明了人CSF 中的蛋白质及多肽在浓度及结构等方面的变化也能反映中枢神经系统感染的病理生理信息，是一个被忽略的、有待开发的宝库，可被用于寻找发病机制的目标蛋白、早期诊断的生物标记物。CSF 蛋白质成分的改变揭示了中枢神经系统疾病的病理生理过程和分子发病机制，是目前神经系统疾病研究的热点之一[6]CSF 在于蛛网膜下腔，环绕着脑和脊髓，主要由脉络丛、室管膜分泌产生。包括小分子物质、盐、肽类、蛋白质和酶，他们在生理过程中发挥着重要作用。CSF 蛋白质存在模式和浓度的改变可以精确反映中枢神经系统疾病的病理过程[7]，通过CSF 蛋白质组学研究，为各种中枢神经疾病提供了。由疾病特异性蛋白（disease specific proteins， DSPs）制备的结脑特异性蛋白质诊断芯片用于诊断，较常规抗酸染色法更高效、更灵敏。

图表1