化妆品及香精中27种香料的气相色谱-质谱检测方法

刘思然, 朱 英

(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所, 北京 100021)

香料作为化妆品的重要组成部分具有改变产品气味、使其散发独特芬芳的作用。然而伴随不断的发展与应用,香料带来的安全性问题也愈发凸显。最常见的为香料过敏,占到全部化妆品过敏案例的三分之一以上[1],在标准系列抗原斑贴试验中,芳香混合物、松香等物质阳性率通常处于较高水平[2],香料过敏临床表现则多为变应性接触性皮炎。除过敏外,香料使用不当还可导致中毒等其他不良影响。

本文选择欧盟化妆品法规(EC1223-2009-EU Cosmetics Regulation-in Force)[3]规定含量超过一定水平时需在化妆品标签上予以标注的24种易致敏合成香料以及我国《化妆品安全技术规范》(2015年版)[4]和欧盟化妆品法规有明确使用限制的6-甲基香豆素、麝香二甲苯和酮麝香3种香料(6-甲基香豆素可用于口腔卫生用品但禁用于化妆品;麝香二甲苯和酮麝香为化妆品限用组分),共计27种香料,建立同时测定化妆品及香精中上述香料的检测方法,并对市售29份香精及40份外包装标识含有香料的化妆品进行测定,为了解国内化妆品与香精市场香料使用情况提供数据支持,为进一步强化致敏香料的规范使用提供客观依据。

对于欧盟化妆品法规规定的24种香料,常见的检测方法包括气相色谱法[5-7]和液相色谱法[8,9],所测定的香料种类有1种或多种,国际日用香料香精协会(以下简称IFRA)曾发布上述24种香料的气相色谱-质谱检测方法[5],但缺少必要的前处理步骤及色谱柱的选择原则、方法特性指标等详细信息,缺乏可重复性。王玉健等[8]曾建立香水中类过敏原香料的液相色谱质谱检测方法,但前处理方法与检测样品仅限于香水。对于其余3种香料,检测6-甲基香豆素多用液相色谱法[10],检测麝香二甲苯、酮麝香等麝香类物质多采用气相色谱法[11-13]。本文在IFRA发布的检测方法的基础上,细化样品前处理步骤、优化色谱条件,并增加我国重点关注的禁限用组分。目前尚未见到同时测定化妆品及香精中27种香料的相关报道。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪,电子轰击离子(EI)源(美国安捷伦公司), T-214万分之一分析天平(美国丹佛公司), Vortex Genie 2多用途涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)。

27种香料标准品:戊基肉桂醛(amyl cinnamal)、丁香酚(eugenol)、羟异己基3-环己烯基甲醛(hydroxyisohexyl-3-cyclohexene carboxaldehyde)、茴香醇(anise alcohol)、金合欢醇(farnesol)(美国AccuStandard公司),水杨酸苄酯(benzyl salicylate)(德国Fluka公司), 6-甲基香豆素(6-methylcoumarin)(中国百灵威公司),苯甲醇(benzyl alcohol)、肉桂醇(cinnamyl alcohol)、柠檬醛(citral)、羟基香茅醛(hydroxycitronellal)、异丁香酚(isoeugenol)、戊基肉桂醇(amyl cinnamyl alcohol)、肉桂醛(cinnamal)、香豆素(coumarin)、香叶醇(geraniol)、肉桂酸苄酯(benzyl innamate)、丁苯基甲基丙醛(butylphenyl methylpropional)、芳樟醇(linalool)、苯甲酸苄酯(benzyl benzoate)、香茅醇(citronellol)、己基肉桂醛(hexyl cinnamal)、苧烯(limonene)、2-辛炔酸甲酯(mehtyl 2-octynoate)、α-异甲基紫罗兰酮(alpha-isomethylionone)、麝香二甲苯(musk xylene)、酮麝香(musk ketone)(德国Dr. Ehrenstorfer公司)。各香料标准品纯度从72.1%～99.7%不等,麝香二甲苯标准品为100 mg/L环己烷溶液,其余标准品溶液配制时根据实际纯度换算后称取。甲醇(色谱纯,德国Merck公司);超纯水(18.2 MΩ·cm,朗泰纯水机)。

1.2 标准溶液配制

准确称取适量香料标准品(麝香二甲苯除外)溶于甲醇,分别配制成质量浓度为4 g/L的标准储备溶液。临用时移取储备溶液及麝香二甲苯标准溶液适量,配制成各组分质量浓度为100 mg/L(麝香二甲苯质量浓度为8.00 mg/L)的混合标准溶液。取混合标准溶液,用甲醇稀释成各组分质量浓度为1.00、5.00、10.0、25.0和50.0 mg/L的混合标准系列溶液(麝香二甲苯质量浓度为0.080、0.400、0.800、2.00和4.00 mg/L)。

1.3 样品前处理

1.3.1香精

称取0.1 g(精确到0.000 1 g)样品于具塞比色管中,用甲醇定容至25 mL,充分振荡均匀,若浓度过高可适当稀释,经0.45 μm有机相滤膜过滤,进样分析。

1.3.2化妆品

液体类化妆品(含香水):称取0.2 g(精确到0.000 1 g)样品于具塞比色管中,用甲醇定容至10 mL,充分振荡均匀,若浓度过高可适当稀释,经0.45 μm有机相滤膜过滤,进样分析。

乳液、霜、膏等其余类别化妆品:称取0.5～1.0 g(精确到0.000 1 g)样品于具塞比色管中,加入0.5 mL饱和氯化钠溶液,用甲醇定容至10 mL,充分振荡均匀,必要时超声,取上清液经0.45 μm有机相滤膜过滤,进样分析。

1.4 色谱条件

色谱柱:HP-5MS弱极性毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);载气:氦气;载气总流量:24 mL/min;分流比:1∶20;分流流量:20 mL/min;进样量:1 μL;进样口温度:250 ℃;升温程序:80 ℃保持5 min后,以10 ℃/min升至250 ℃,保持5 min;运行时间:27 min。

1.5 质谱条件

离子化方式:EI离子源;扫描范围:30～500 amu;采集模式:全扫描;定量模式:选择离子定量;碰撞能量:70 eV;溶剂延迟:3.00 min; MS离子源温度:230 ℃; MS四极杆温度:150 ℃。各化合物分析条件见表1。

表 1 27种香料的保留时间与特征离子Table 1 Retention time and characteristic ions for the 27 fragrances

*Quantifier ions. Citral has two peaks at 9.750 and 10.250 min, respectively.

2 结果与讨论

2.1 条件优化

2.1.1标准溶液保存条件

因香料挥发性较强,标准溶液保存条件选择不当则会影响其稳定性。本文探索常温(NPT)、4 ℃冷藏、-20 ℃冷冻3种保存方式对其稳定性的影响,以确定标准储备溶液的保存方式。考虑到工作量,取混合标准系列溶液中浓度最高的一组溶液密封于样品瓶中,上述保存方式各放置5瓶,分别于放置第1、3、4、5和6天各取1瓶上机检测其稳定性。

测定结果表明,不同香料的稳定性差异较大,且与保存时间、保存方式密切相关。多数香料在放置3～4天时浓度基本稳定或略有上升,随后逐渐下降,到第6天时下降明显。究其原因,可能是放置的最初几天,甲醇和香料的挥发均不明显或甲醇的挥发略快于香料,导致香料表现出轻微的浓缩效果;随后几天,香料的挥发速度明显快于甲醇,导致香料浓度逐渐下降。其中,冷藏保存的标准溶液,整体变化趋势较其他2种条件更加平稳。

在测试期内,以变化率≤10%的最多天数确定保存时间,天数相同时以变化趋势最缓确定保存方式,并将结果外推至浓度更高的标准储备溶液,混合标准系列溶液则建议现用现配。27种香料标准储备溶液的推荐保存条件见表2。

2.1.2样品前处理方法

鉴于27种香料在甲醇中的溶解度均很好,香精及香水等液体类化妆品直接用甲醇分散并振荡均匀即可。乳霜等其他类别化妆品,只用甲醇不易分散,提取效果不佳,因此考察了破乳、振荡、超声等操作对提取效果的影响。

选取一份加入甲醇后振荡即可分散均匀的样品及一份在振荡情况下不能分散均匀的样品进行对比,各提取条件下样品分散情况及以芳樟醇、香茅醇、香叶醇含量为例的检测结果见表3。

结果表明,加入0.5 mL氯化钠饱和溶液有很好的破乳作用,提取效果明显改善;振荡有利于分散样品,也能提高提取效果;超声萃取虽然能够改善样品的分散效果,但也可能会加快香叶醇等部分香料的挥发,导致提取效率反而下降。综合考虑,前处理方法的选择原则是,首先尽量简化操作,减少香料挥发;其次,对于能够通过加入氯化钠饱和溶液破乳、振荡分散的样品,不建议使用超声提取方式,只在必要时慎重使用超声提取。

表 2 27种香料储备液的推荐保存条件Table 2 Recommended save conditions for the standard stock solution of the 27 fragrances

NPT: normal pressure and temperature.

2.1.3色谱柱的选择

考虑到27种合成香料都具有一定极性,本研究比较了强极性(HP-INNOWax, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)、中极性(DB-225MS, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)与弱极性(DB-5MS, 30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱中各组分的分离情况。强极性色谱柱因热稳定性不强,在升温到一定程度时,基线易漂移,影响检测结果,只同时检出13种物质,且检出限较高。中极性色谱柱有5种物质无法检出,包括羟基香茅醛、肉桂酸苄酯、金合欢醇、麝香二甲苯和酮麝香,在温度升高至150 ℃附近时,基线漂移,且漂移对化合物检出限的影响随温度上升而加剧。弱极性色谱柱能够同时检测出全部27种香料,分离度理想(详见图1)。综合考虑化合物的检出限、分离度与总运行时间,选择弱极性色谱柱进行检测。

图 1 弱极性色谱柱检测27种香料总离子流图Fig. 1 Total ion chromatograms for the 27 fragrances using a weak polar column The mass concentration of musk xylene is 2.00 mg/L, and the mass concentrations of the others are 25.0 mg/L. Peak Nos.: 1. limonene; 2. benzyl alcohol; 3. linalool; 4. mehtyl 2-octynoate; 5. citronellol; 6. citral-1; 7. geraniol; 8. citral-2; 9. cinnamal; 10. anise alcohol; 11. cinnamyl alcohol; 12. eugenol; 13. coumarin; 14. hydroxycitronellal; 15. isoeugenol; 16. alpha-isomethylionone; 17. butylphenyl methylpropional; 18. 6-methylcoumarin; 19. amyl cinnamal; 20. hydroxyisohexyl-3-cyclohexene carboxaldehyde; 21. amyl cinnamyl alcohol; 22. farnesol; 23. hexyl cinnamal; 24. benzyl benzoate; 25. musk xylene; 26. benzyl salicylate; 27. musk ketone; 28. benzyl innamate.

2.2 方法特性

2.2.1线性范围和检出限

以化合物的质量浓度(mg/L)对相应的峰面积做外标标准曲线。羟异己基3-环己烯基甲醛、羟基香茅醛及麝香二甲苯分别在5～50、5～50和0.4～4 mg/L,其余24种香料在1～50 mg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于等于0.996。以3倍信噪比计算检出限,10倍信噪比计算定量限,并以称取1 g样品稀释至10 mL计,羟异己基3-环己烯基甲醛、羟基香茅醛及麝香二甲苯的定量限分别为50、50和4 mg/kg,其余24种香料定量限为10 mg/kg,详见表4。

表 4 27种香料的线性范围、回归方程、相关系数(r)、检出限和定量限Table 4 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), LODs and LOQs of the 27 fragrances

表 4 (续)Table 4 (Continued)

x: peak area;y: mass concentration, mg/L. The two citral peaks, at 9.750 and 10.250 min, are combined in the quantification.

表 5 空白样品加标回收率和精密度(n=6)Table 5 Spiked recoveries and precisions of the blank samples (n=6)

The two citral peaks, at 9.750 and 10.250 min, are combined in the quantification.

对于欧盟化妆品法规规定的24种香料,因具有较宽的极性范围,因此对于此类物质的检测方法中同时检测物质通常为十余种。若为满足更多香料的同时检测需求,通常在灵敏度上会有所牺牲,采用色谱-质谱法检测的检出限通常为2～20 mg/kg[6,8,9]。本方法对麝香二甲苯、羟基香茅醛和羟异己基3-环己烯基甲醛的检出限分别为1.2、15和15 mg/kg,其余香料检出限为3.0 mg/kg,经实际样品测试,能够满足其对香料成分的定性定量分析。为满足27种香料成分同时检测的需求,本方法牺牲了部分灵敏度,对于灵敏度要求较高的样品,可尝试进一步优化羟基香茅醛与羟异己基3-环己烯基甲醛的色谱-质谱条件或更换更适宜的检测方法,以获取更低的检出限和更高的灵敏度。

2.2.2加标回收率

在化妆品空白基质中添加1.2节中的混合标准溶液,至香料终质量浓度分别为5.00、25.0和50.0 mg/L(麝香二甲苯为0.400、2.00和4.00 mg/L),采用本法进行样品前处理与气相色谱-质谱分析,各水平检测2份平行样品。回收率检测结果见表5,除麝香二甲苯外均在81.5%～118%之间。麝香二甲苯回收率较低,为73.3%～76.1%。可能由于香料标准品本身挥发性较强,且实验过程中加标浓度较低,经过一系列前处理后造成待测组分损失,导致实际加标量低于添加理论值。

2.2.3精密度

对27种香料各选择低、中、高3种质量浓度(质量浓度同2.2.2节)进行加标,平行测定6份,计算精密度,结果见表5。27种香料的相对标准偏差皆小于10%(1.70%～9.71%之间),满足检测需求。

表 6 27种香料的检出量及检出率结果Table 6 Results of the detected contents and detection rates for the 27 fragrances

ND: not detected.

2.3 实际样品检测

选取69份样品进行检测(其中香精29份、香水19份、其他类别外包装标识含有香料的化妆品21份),均检出含有除6-甲基香豆素外的26种香料中的1种或多种,检出香料的含量范围在0.001%～32.2%之间,具体结果见表6。

香精样品中香料的使用水平相对较高,检出香料的含量范围在0.001%～32.2%之间,使用率较高的依次是苧烯、芳樟醇和水杨酸苄酯,未检出6-甲基香豆素。有2份样品检出麝香二甲苯,购买时厂家明确建议,应适当稀释,使其在化妆品中的添加量符合《化妆品安全技术规范》(2015年版)[4]的规定。为避免由于香料使用方法不当导致的安全隐患,厂商应在消费者购买时做出正确的使用引导。

香水样品中检出香料的含量范围在0.008%～3.28%之间,使用率较高的依次是水杨酸苄酯、苧烯和柠檬醛,未检出6-甲基香豆素和麝香二甲苯。其他外包装标识含有香料的化妆品中香料的使用水平最低,添加率与浓度水平远远低于香精与香水,含量范围在0.002%～0.980%之间,检出率较高的依次是水杨酸苄酯、芳樟醇、苯甲醇和香茅醇,未检出丁香酚、6-甲基香豆素、戊基肉桂醇和麝香二甲苯4种香料。香水与其他类别化妆品中,共有3份样品检出酮麝香,浓度均低于《化妆品安全技术规范》(2015年版)[4]的限制要求,符合规定,可以放心使用。

测定结果表明,香精、香水和其他类别化妆品中香料的使用种类和使用量依次降低,使用习惯则基本一致。在3类样品中添加率较高的香料为水杨酸苄酯、苧烯、芳樟醇等,而添加率最低的则是麝香二甲苯、酮麝香、茴香醇和肉桂醛(6-甲基香豆素除外),这与笔者所进行的化妆品中致敏原香料标注情况调查结果基本一致[14]。此外,69份样品中除1份样品使用1种香料外,其余样品均复配使用多种香料,以达到预期效果。

3 结论

本文通过对标准溶液保存条件、前处理方法、色谱柱等相关条件进行探索、优化,建立了27种香料的气相色谱-质谱联用检测方法,在方法特性上基本满足检测需求。与IFRA发布的检测方法相比,该方法明确了样品前处理步骤,优化了色谱条件,增加了方法特性指标信息,并增加了我国重点关注的禁限用组分。利用所建立方法,对29份香精及40份外包装标识含有香料的化妆品进行测定,实际样品检测结果与香料标注情况调查结果基本一致,为了解国内化妆品与香精市场香料使用情况提供数据支持。

本研究在以下几方面还有待完善:对于羟异己基3-环己烯基甲醛和羟基香茅两种香料,为了满足同时检测的需求,牺牲了灵敏度,对于灵敏度要求较高的样品,可尝试进一步优化色谱-质谱条件或更换更适宜的检测方法,以获取更低的检出限和更高的灵敏度。对于麝香二甲苯,可更换浓度较高的标准品以增加标准系列溶液中的实际浓度,减少前处理过程中待测组分的损失。