高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中10种生物碱

2019-08-29曹梅荣马俊美翟洪稳赵晓雅范素芳

色谱 2019年9期

曹梅荣, 马俊美, 王娟, 翟洪稳, 赵晓雅, 范素芳

(河北省食品检验研究院, 河北省食品安全重点实验室, 河北石家庄 050091)

随着消费者对于绿色功效性化妆品的推崇,化妆品研发人员越来越多的从天然植物中寻找原料。目前,部分植物提取物中的功能性成分在改善皮肤外观、调理皮肤状态、养发护发等方面具有显著作用,已被广泛应用于各类化妆品中[1,2]。然而,我们在利用天然植物的有效成分时,必须去除与功能成分并存的有毒活性物物质。例如，乌头中的乌头碱(aconitine)、次乌头碱(hypaconitine)和新乌头碱(mesaconitine)等二萜类型生物碱能麻痹感觉神经和中枢神经,毒害心肌细胞,导致心脏中毒而危害生命[3]。茄科植物中的阿托品(atropine)和东莨菪碱(scopolamine),属于莨菪烷型生物碱,具有散瞳、抑制腺体分泌和大脑皮质的作用[4]；马钱子中主要的有毒成分为番木鳖碱(brucine)和士的宁(strychnine),会对中枢神经系统产生影响,甚至造成肾脏和心肌损伤[5]。化妆品安全技术规范(2015年版)[6]明确规定化妆品中禁止使用东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、秋水仙碱(colchicine)、阿托品和士的宁。因此,建立化妆品中有毒生物碱的检测方法,对于保障化妆品的安全,为国家化妆品质量监测提供技术支撑,对完善化妆品的风险监测技术体系具有重要意义。

目前,测定生物碱的方法主要有高效液相色谱法[7,8]、超临界液相色谱法[9,10]、液相色谱-串联质谱法[11-15]、气相色谱-串联质谱法[16]、薄层色谱法[17]和毛细管电泳法[18]。其中,LC-MS/MS以其灵敏度高、适用范围广、选择性和特异性好等优点,成为检测多种生物碱最为常见的方法。范素芳等[11]建立了LC-MS/MS测定食品中15种有毒生物碱的方法,并对植物源饮料、粮食及果蔬中15中生物碱进行了定量检测。张春华等[15]建立了LC-MS/MS同时检测尿液和胃液中12种有毒生物碱的方法,优化了前处理过程和LC-MS/MS条件,探讨了质谱碎裂机理。目前，LC-MS/MS测定多种生物碱的基质多集中在中草药材[5,7-9]、食品[11]、血液[12]、胃液和尿液[15]等生物制品,化妆品相关的检测研究较少。本研究采用超声波提取技术结合高效液相色谱-串联质谱法建立了一种同时测定化妆品中东莨菪碱、番木鳖碱、乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、秋水仙碱、阿托品、士的宁、喜树碱(camptothecin)和毛果芸香碱(pilocarpine)10种生物碱的检测方法。该方法前处理操作简单,检测灵敏度高,适用于化妆品中10种有毒生物碱的安全风险筛查和定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Triple Quad 6500三重四极杆质谱仪,配有电喷雾电离(ESI)源(美国AB Sciex公司);岛津20A高效液相色谱仪(日本岛津公司); 3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司); P300H超声波清洗器(德国Elma公司); VORTEX 3涡旋混匀仪(德国IKA公司)。

乙腈、乙醇、甲醇均为色谱纯(美国Fisher公司);正己烷为分析纯(北京化学试剂公司);甲酸为色谱纯(美国Supelco Analytical公司);实验所用水均为屈臣氏蒸馏水(屈臣氏集团(香港)有限公司); 10种生物碱标准品(纯度≥99%)购于上海源叶生物科技有限公司;Oasis MCX固相萃取阳离子交换柱(60 mg/3 mL)购于美国Waters公司。

1.2 标准溶液的配制

标准溶液的配制:称取10种生物碱标准品10 mg,分别置于100 mL容量瓶中,用50%(v/v)乙醇水溶液溶解配制成100 mg/L的标准储备液,储存于4 ℃冰箱。

混合标准储备溶液:分别准确移取上述标准储备溶液各1 mL,置于100 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成质量浓度均为1.0 mg/L的10种生物碱混合标准储备溶液,于4 ℃避光保存。

1.3 样品前处理

水剂类化妆品和膏霜乳液类化妆品(水包油)样品:准确称取试样约1.0 g,置于50 mL具塞塑料离心管中,准确加入15 mL 80%(v/v)甲醇水溶液,涡旋分散均匀后,超声提取15 min, 用80%(v/v)甲醇水溶液定容至20 mL,以9 000 r/min离心10 min,移取上清液,过微孔滤膜,待测定。

膏霜乳液类化妆品(油包水)样品:准确称取试样约1.0 g,置于50 mL具塞塑料离心管中,加入5 mL正己烷,分散均匀后,准确加入20 mL 80%(v/v)甲醇水溶液,超声提取15 min,以9 000 r/min离心10 min,弃去上层正己烷后,移取下层清液,过微孔滤膜,待测定。

1.4 分析条件

色谱柱:Waters BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm);柱温:30 ℃;流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液,流动相B:乙腈;流速:0.30 mL/min;梯度洗脱程序:0～2.0 min, 10%B; 2.0～6.0 min, 10%B～25%B; 6.0～23.0 min, 25%B; 23.0～23.1 min, 25%B～10%B; 23.1～25.0 min, 10%B。进样量:2 μL。

离子源:ESI源,正离子模式;离子源温度:500 ℃;喷雾电压:5.5 kV;气帘气压力:0.21 MPa;雾化气压力:0.34 MPa;辅助气压力:0.34 MPa;扫描模式:多反应监测(MRM)模式。10种生物碱的其他质谱参数见表1。

表 1 10种生物碱的质谱参数Table 1 MS parameters of the ten alkaloids

* Quantitative ion.

图 1 (a)不同提取溶剂和(b)不同体积分数的甲醇水溶液对10种生物碱回收率的影响(n=3)Fig. 1 Effect of (a) different extraction solvents and (b) different volume percentages of methanol aqueous solution on the recoveries of the ten alkaloids (n=3)

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1提取溶剂的选择

生物碱的溶解性能是设置提取方法的重要依据,传统提取生物碱的方法有水、酸水、醇类和亲酯性有机物提取等[19]。10种生物碱存在极性差异,在溶解性上也存在差异,如秋水仙素碱和阿托品易溶于水,但番木鳖碱和喜树碱不溶于水,溶于甲醇和乙醇等有机溶剂。为更好地从化妆品中提取出10种生物碱,考察了水剂类化妆品为基质时,乙醇-水(50∶50, v/v)甲醇-水(50∶50, v/v)和乙腈-水(50∶50, v/v)的提取效果。经3种提取液提取后所得的回收率结果见图1a。结果表明,用甲醇-水(50∶50, v/v)提取时,毛果芸香碱、番木鳖碱、的士宁、阿托品和乌头碱的回收率明显高于另外两种提取溶剂。虽然喜树碱用甲醇-水(50∶50, v/v)提取的回收率较另外两种溶剂的提取回收率低,但是回收率也达到了80%。综合比较,实验选用甲醇水体系作为提取溶剂。

实验继续考察了体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的甲醇水溶液的提取效果。通过图1b的结果分析,对于不易溶于水的番木鳖碱、的士宁和喜树碱而言,随着甲醇比例的增加,3种生物碱的回收率也逐渐增加,当甲醇的体积分数升至80%以后,3种生物碱的回收率为97.5%～102.9%。其他7种生物碱的回收率随甲醇比例变化不明显,回收率为90.0%～103.3%。因此最终选择80%(v/v)的甲醇水溶液为提取溶剂。

2.1.2净化方法的考察

化妆品的基质复杂,含有大量的表面活性剂和脂溶性物质,并且生物碱类物质在化妆品中的含量较低。因此,为提高检测的灵敏度,本实验拟采用阳离子交换固相萃取柱[20]对样品进行净化、浓缩,选择水剂类化妆品型爽肤水为基质,10种生物碱的添加水平为100 μg/kg,考察10种生物碱的回收率。结果表明,经阳离子交换柱后,秋水仙碱未检出;毛果芸香碱、喜树碱回收率低于60%,番木鳖碱的回收率为75.6%,其他6种生物碱的回收率为86.3%～110.7%。说明阳离子固相萃取柱不适合目标物的净化,最终样品前处理过程不考虑采用固相萃取净化。

2.2 分析条件的优化

2.2.1色谱条件的优化

对比了3种色谱柱Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)、Thermo Accuore-150 C18(100 mm×2.1 mm, 2.5 μm)和资生堂Capcell PAK(100 mm×2.1 mm, 2 μm)对10种生物碱的分离效果。结果表明,使用BEH C18色谱柱时,10种生物碱实现了基线分离,峰形良好,峰响应也较高;使用Accuore-150 C18色谱柱时,番木鳖碱和阿托品没有基线分离;使用Capcell PAK色谱柱时,10种生物碱峰形良好,但峰面积偏小。因此实验后续选择BEH C18色谱柱。

实验考察了采用0.1%(v/v)甲酸水溶液或10 mmol/L乙酸铵溶液为流动相A、乙腈为流动相B对10种生物碱色谱行为和离子化程度的影响。实验发现,当流动相为10 mmol/L乙酸铵溶液-乙腈时,毛果芸香碱的峰形较宽且拖尾严重,士的宁和番木鳖碱不能基线分离,并且喜树碱的响应值特别低。当流动相为0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈时,各种目标物的信号响应高,尤其是喜树碱的响应强度有明显增高,峰形尖锐对称,分离度能满足检测要求。因此实验采用0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈体系作为流动相。

2.2.2质谱参数的优化

10种生物碱的化学结构中都含有杂环原子,在电喷雾电离源、正离子模式(ESI+)下易得到一个H+,形成[M+H]+准分子离子峰。选择ESI+模式对100 μg/L的10种生物碱混合标准溶液进行质谱条件的优化。采用全扫描的方式确定各分析物的母离子,通过调整气帘气压、辅助气压、喷雾气压和离子源温度等参数,使各标准物质的[M+H]+准分子均可达到较高的响应值。采用二级质谱扫描方式选择响应较高的2个碎片离子,优化碰撞能和去簇电压值等参数。最终选定母离子和2个特征子离子进行定性分析,选择其中响应值高的子离子的作为定量离子。10种生物碱标准物质优化后的质谱参数见表1，总离子流色谱图见图2。

图 2 10种生物碱(100 μg/L)的总离子流色谱图Fig. 2 Total ion chromatogram of the ten alkaloids (100 μg/L)1. pilocarpine; 2. scopolamine; 3. strychnine; 4. brucine; 5. atropine; 6. colchicine; 7. camptothecin; 8. mesaconitine; 9. hypaconitine; 10. aconitine.

2.3 基质效应(ME)评价

本实验评价了化妆品基质对10种生物碱离子化效果的影响。通过公式ME=A/B×100%评价其基质效应。其中,A表示空白基质液配制的标准溶液的响应值;B表示80%(v/v)甲醇水溶液配制的标准溶液的响应值。当ME大于100%时,表示存在基质增强效应;当ME小于100%时,表示存在基质抑制效应;当ME等于100%时,表示不存在基质效应。实验测定了两种溶液配制的20 μg/L混合标准溶液的离子响应强度比值,平行测定3次。结果表明,阿托品和东莨菪碱在3种化妆品中均有明显的基质抑制效应,10种生物碱的平均基质效应为56.2%～98.7%。因此本实验选用空白基质的提取液配制标准溶液进行定量。

2.4 线性范围、检出限和定量限

用空白基质提取液将10种生物碱混合标准储备液逐级稀释成0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的混合标准工作液,在上述确定的分析条件下测定,平行测定3次。以各生物碱定量子离子的质谱峰面积为纵坐标(Y),混合标准工作液的质量浓度为横坐标(X, μg/L)进行回归分析,得到线性回归方程。结果表明,10种生物碱化合物在各自的范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.99。采用标准添加法来确定方法的检出限和定量限,以3倍和10倍信噪比下各待测物的质谱响应值计算化妆品基质中10种生物碱的检出限和定量限,结果见表2。

表 2 10种生物碱的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the ten alkaloids

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 方法的回收率和精密度

分别向空白水剂类化妆品和膏霜乳液类化妆品样品中添加中1倍、2倍和6倍定量限的标准品,每个水平重复测定6次。按照1.3节方法提取并分析,计算10种生物碱的加标回收率和相对标准偏差(见表3)。结果显示,10种生物碱在膏霜乳液、水剂类化妆品基质的平均加标回收率为70.91%～116.75%, RSD为0.49%～9.98%,满足标准检测方法的要求。

表 3 化妆品中10种生物碱的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the ten alkaloids in the cosmetics (n=6)

表 3 (续)Table 3 (Continued)

2.6 稳定性

实验考察10种生物碱在提取溶液中放置24 h内的稳定性。在空白水剂类化妆品样品中添加待测物,添加水平分别为阿托品12.5 μg/kg,次乌头碱和新乌头碱25.0 μg/kg,其他50.0 μg/kg。按照1.3节方法提取后,放置0、4、8、12、16、20和24 h后分别测定提取溶液中10种生物碱的峰面积,并计算其相对标准偏差。结果表明,在24 h内提取溶液中10种生物碱峰面积的相对标准偏差为1.25%～9.02%,符合检测要求。