柱后加碱-高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定 农田土中草铵膦、氨甲基膦酸和草甘膦残留

陶雪梅, 朱红霞, 高立红, 李仁勇

(1. 甘肃省环境监测中心, 甘肃 兰州 730030; 2. 中国环境监测总站, 北京 100012; 3. 赛默飞世尔科技 (中国)有限公司应用研发中心, 北京 100085; 4. 中科谱研(北京)科技有限公司, 北京 100027)

草甘膦(glyphosate, GLY, C3H8NO5P)和草铵膦(glufosinate, GLUF, C5H15N2O4P)都是常用广谱除草剂;氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid, AMPA, CH6NO3P)是草甘膦的主要降解产物。草甘膦属灭生性除草剂,草铵膦属触杀性除草剂。草甘膦因高效、低价、人体代谢快等优势使用量大、应用广泛[1],而草铵膦则是以其除草迅速、可去除多年生恶性杂草的优势,作为新一代除草剂进入市场[2]。随着这两种除草剂使用量日益增大,其在土壤中的残留问题越来越受到关注。目前已有多项研究表明,草甘膦和草铵膦具有毒性作用,对土壤生态环境和人体健康都具有潜在危害[3-11]。Marlise等[12]研究了草甘膦对新生大鼠子宫形态以及细胞分化增殖蛋白表达的影响,认为草甘膦有引起女性生育能力下降并致子宫瘤的可能。

目前测定土壤中草甘膦、氨甲基膦酸和草铵膦残留量的方法主要有气相色谱法[13,14]、液相色谱法[15-18]、高效液相色谱-串联质谱法[19-25]和离子色谱法[26-28]。由于3种目标物的水溶性强且没有紫外吸收,用气相色谱和液相色谱检测都需繁琐的衍生过程。液相色谱-质谱法则因其公认的操作繁琐而应用并不普遍。故而离子色谱法有一定的优势。

现有文献报道[26-28]中使用离子色谱法测定3种目标物时,使用的检测器均为电导检测器,目前暂无离子色谱-安培检测法同时测定3种农药的文献报道。常见阴离子在电导检测时有响应,基质干扰大,导致目标物检测的灵敏度低、检出限高。而在安培检测器上,常见阴离子无响应,这使该方法在选择性和灵敏度方面优势明显。本研究选用2 mmol/L氢氧化钠振荡提取,IC-C18和IC-Na柱固相萃取净化,采用离子色谱-安培检测法同时测定农田土中草甘膦、草铵膦和氨甲基膦酸。前处理操作简单快速,回收率高,定性定量准确,分析速度快,能满足实际工作的需要。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ICS5000+离子色谱仪,配脉冲安培检测器(美国Thermo Fisher公司); 0.1 mg和0.01 mg分析天平(瑞士梅特勒公司); Milli-Q超纯水仪(成都唐氏康宁科技发展有限公司);小型振荡器(北京国环高科自动化技术研究院);水系针式过滤器(0.22 μm,杉羽天津科技发展有限公司); IC-C18柱和IC-Na柱(中国Agela公司); 50%氢氧化钠水溶液(英国AlafAesar公司);氨甲基膦酸(纯度≥99.9%)和草甘膦(纯度≥98.6%)(德国Dr. Ehrenstorfer公司),草铵膦(上海Aladdin industrial Corporation公司)。

1.2 实验方法

1.2.1仪器条件

离子色谱条件:IonPacAS11-HC色谱柱(250 mm×4 mm);流速0.5 mL/min;柱温35 ℃;进样量200 μL;淋洗液为100 mmol/L氢氧化钠和纯水,梯度条件见表1;柱后加碱淋洗液及流速为100 mmol/L氢氧化钠,0.2 mL/min。

表 1 NaOH梯度淋洗程序Table 1 Gradient of NaOH elution procedure

A: H2O; B: 100 mmol/L NaOH.

1.2.2样品前处理

提取:参照HJ/T 166土壤环境监测技术规范,将土样风干后过60目筛。称取2.5 g试样(精确至0.001 g)于50 mL具塞聚乙烯管中,加入50 mL 2 mmol/L氢氧化钠溶液,300 r/min下振荡1 min。

净化:将提取液依次用0.22 μm水系针式滤器、IC-C18和IC-Na柱净化,弃去2 mL初流出液后开始收集,待测。

2 结果与讨论

2.1 离子色谱柱的选择

选用实验室常用的4种阴离子色谱柱,研究它们对3种目标物的分离效果:IonpacAS20(250 mm×2 mm)、IonpacAS23(250 mm×4 mm)、IonpacAS19(250 mm×4 mm)和IonpacAS11-HC(250 mm×4 mm)。结果表明:草铵膦和氨甲基膦酸在IonpacAS20柱上不能完全分离;目标物在IonpacAS23柱和IonpacAS19柱上的响应较低;目标物在IonpacAS11-HC柱上的响应高,且草铵膦和氨甲基膦酸分离较好。故最终选用IonpacAS11-HC色谱柱(250 mm×4 mm)。色谱柱型号不同,填料的粒径、键合功能基和数量、亲水性能等均有一定差异,因此会出现有些色谱柱响应低且不能有效分离的现象。

2.2 检测器的选择

图 1 加标土壤样品的色谱图(电导检测器)Fig. 1 Chromatogram of a spiked soil sample(conductivity detector) Spiked levels: GLUF, 1.00 mg/L; AMPA, 1.00 mg/L; GLY, 1.00 mg/L.

2.3 离子色谱条件的优化

IonpacAS11-HC色谱柱(250 mm×4 mm)在流速为1.0 mL/min时柱效最高。但如图2所示,在此流速下,草铵膦和氨甲基膦酸的色谱峰分离度R<1.5;在0.5 mL/min的流速条件下,草铵膦和氨甲基膦酸可以有效分离。故选用0.5 mL/min的淋洗液流速。

图 2 淋洗液流速对加标土壤样品分离的影响Fig. 2 Effect of the eluent flow rate on the separation of the spiked soil sample Spiked levels: 0.10 mg/L.

草铵膦和氨甲基膦酸在IonpacAS11-HC上的保留较弱,而草甘膦在IonpacAS11-HC上的保留较强。且在一定浓度范围内,随着淋洗液的浓度升高,3种目标物的峰面积变大。但当淋洗液浓度大于30 mmol/L时,草铵膦和氨甲基膦酸不能完全分离。为解决该问题,选用梯度淋洗和柱后加碱的方法[29-31],在色谱柱后、检测器前增加一路低流速、高浓度的淋洗液,提高目标物测定的灵敏度。如图3所示,柱后加碱可使草甘膦的检查灵敏度明显提高。

图 3 柱后加碱对标准溶液分离的影响Fig. 3 Effect of the post-column addition of alkali on the separation of the standard solution Mass concentrations: 0.50 mg/L.

按照优化的色谱条件(见1.2.1节),所得加标实际样品的色谱图见图4。

2.4 提取剂的选择

应用离子色谱法测定3种目标物时,常用的提取液为纯水和碱溶液[19-21]。提取液浓度对不同目标物提取效率的影响程度不同。如图5所示,随着氢氧化钠浓度的升高,草铵膦和草甘膦的加标回收率逐渐降低;而氨甲基膦酸的加标回收率逐渐升高,在10 mmol/L时达到最大回收率102.4%。为实现3种目标物同时测定,且尽量少引入干扰,最终选用2 mmol/L氢氧化钠作为提取剂。

图 4 加标土壤样品的色谱图(安培检测器)Fig. 4 Chromatogram of a spiked soil sample(amperometric detector)Spiked levels: GLUF, 1.00 mg/L; AMPA, 0.20 mg/L; GLY, 1.00 mg/L.

图 5 氢氧化钠提取液浓度对加标回收率的影响Fig. 5 Effect of the concentration of sodium hydroxide on the spiked recovery

图 6 超声提取和振荡提取对目标物测定的影响Fig. 6 Effect of the ultrasonic extraction and the shaking extraction on the determination of the targets

2.5 提取方式的选择

对比超声提取和机械振荡提取两种提取方式,结果如图6所示。超声提取后,提取液中杂质峰较大,影响目标物(尤其是草铵膦)的测定。原因可能是,超声提取时,样品温度升高,干扰物的提取量增加,而干扰物的保留时间与草铵膦接近,影响了定量。振荡提取时,3种目标物的加标回收率满足要求。

2.6 老化时间的影响

测定土壤样品的加标回收率,不可避免地要讨论标准溶液滴入土壤中的老化时间,以保证加标样在实际土壤上的吸附平衡。在2.5 g土壤样上滴加50 μL 250 mg/L的混合标准溶液,放置不同时间后测定,结果如图7所示。可见放置时间对氨甲基膦酸的影响不大;而草铵膦和草甘膦的加标回收率在放置5 h后低于70%,且在5 h时滴入的50 μL标准溶液已干。因此,为保证加标回收率满足要求且标准溶液在土壤中吸附平衡,滴加并放置5 h后进行样品提取。

图 7 老化时间对加标回收率的影响Fig. 7 Effect of the aging time on the spiked recovery

图 8 振荡时间对加标回收率的影响Fig. 8 Effect of the oscillation time on the spiked recovery

2.7 振荡时间的选择

在300 r/min的条件下,在1～15 min内记录目标物的加标回收率,结果如图8所示。3种目标物的加标回收率在不同振荡时间下变化不大。为提高萃取效率,且考虑方法的普适性,最终选取振荡时间为5 min。

2.8 提取剂体积的选择

通过改变提取剂和土壤质量比的方式选择最佳的提取液体积。如图9所示,除5∶1和50∶1时有回收率低于80%的现象外,其他情况下的回收率均在80%～102%之间。为防止样品过度稀释造成灵敏度降低,同时也为满足样品的测定体积,最终选择提取液和土壤样品质量比为20∶1,即1 g土壤用20 mL 2 mmol/L NaOH振荡提取。

图 9 提取剂和土壤的质量比对加标回收率的影响Fig. 9 Effect of the mass ratio of the extractant and the soil sample on the spiked recovery

2.9 净化条件的优化

土壤中含有大量可溶于水的有机物和无机物。由于进样量较大,大量样品测试时会降低色谱柱的使用寿命。为了去除提取液中的干扰杂质,选用IC 柱净化,其中IC-C18柱去除样品基质中的疏水性物质,IC-Na柱去除提取液中的重金属。为保证处理过程对目标物的测定不产生影响,标准溶液先用不同IC柱净化,所得色谱图如图10。目标物的色谱峰重叠性较好,可见IC柱对目标物的测定影响不大,可以用于提取液的净化。

图 10 加标样品经不同IC柱净化后的色谱图Fig. 10 Chromatograms of the spiked sample purified by different IC columns Spiked levels: GLUF, 0.25 mg/L; AMPA, 0.05 mg/L; GLY, 0.25 mg/L.

2.10 检出限和线性方程

按照HJ 168-2010中的检出限计算公式,对低浓度的目标物混合标准溶液平行测定7次,结果见表2。草铵膦、氨甲基膦酸和草甘膦的方法检出限分别为0.08、0.02和0.04 mg/kg,满足土壤环境质量标准(GB 15618-2008征求意见稿)中土壤有机物的第二级标准对草甘膦(0.5 mg/kg)的限值要求。

表 2 草铵膦、氨甲基膦酸和草甘膦的方法检出限(n=7)Table 2 LODs of GLUF, AMPA, and GLY (n=7)

表 3 GLUF、AMPA和GLY的回归方程和相关系数Table 3 Regression equations and correlation coefficients (r2) for GLUF, AMPA and GLY

y: peak area;x: mass concentration of the analyte, mg/L.

用优化后的测定条件对3种目标物的系列混合标准溶液进行分析,其中草铵膦和草甘膦的线性范围是20.0～1 000 μg/L,氨甲基膦酸的线性范围是5.0～400 μg/L。以目标物质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制校准曲线,得出回归方程和线性相关系数(r2),具体如表3所示。

2.11 实际样品测试

采集北京某地农田土,按照优化后的测定条件对样品中的3种目标物进行测定。3种目标物中只有氨甲基膦酸有检出,说明该农田喷洒过除草剂草甘膦,且已经降解成氨甲基膦酸。平行测定6次的相对标准偏差为0.7%～5.0%,加标回收率为80.2%～106%(见表4)。

表 4 3种目标物在农田土中3个水平下的加标回收率(n=6)Table 4 Recoveries of the three targets at three spiked levels in farmland soil (n=6)

ND: not detected.

3 结论

本文建立了一种简单、快捷、同时测定农田土中草铵膦、氨甲基膦酸和草甘膦残留量的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测方法。样品采用2 mmol/L氢氧化钠溶液提取和IC-C18和IC-Na柱快速净化的方法进行样品前处理,IonpacAS11-HC离子色谱柱分离,安培检测器检测。实际样品分析表明本方法抗干扰性强,灵敏度和准确度高,操作简便快捷,适用于农田土壤中草铵膦、氨甲基膦酸和草甘膦残留的同时快速定量分析。