长链非编码RNA HOTAIR 对胃癌的诊断及预后价值

李金秋，许崴崴，孙宇佳，王莹莹

(吉林大学第二医院 胃肠营养及疝外科，吉林 长春130041)

胃癌在我国占肿瘤总死亡率的第二位[1]，主要依靠胃镜下对可疑肿瘤部位取活检后做病理来确诊。肿瘤标志物(CEA,CA125等)对癌症患者的筛查具有预测作用[2]，但敏感性和特异性较低。近年来随着非编码RNA的发现，其在癌症组织和健康组织中存在差异性表达成为研究热点，并有望成为肿瘤的新的血清学标志物及治疗的靶点[3]。HOTAIR作为一种长链非编码RNA已经被证实在胃癌组织中高表达[4]，故本文通过检测胃癌组织中HOTAIR表达差异性并应用生存曲线来明确HOTAIR对胃癌的诊断及预后价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析2010年1月—2014年12月就诊于吉林大学第二医院胃肠营养及疝外科的胃癌患者115例。全部患者均行手术治疗，并经病理学组织活检确诊为胃癌。排除标准：①肿瘤广泛转移者。②胃癌合并严重肝、肾、脑、血液等多器官功能衰竭病例。③术前进行辅助放化疗。④在院死亡病人。其中男73例，女42例，平均年龄58.0±5.8岁。有吸烟史48例，饮酒史54例。肿瘤分期Ⅰ19例，Ⅱ13例，Ⅲ41例，Ⅳ42例。其中低分化49例，高中分化66例。本实验经吉林大学第二医院伦理委员会审核并批准，全部患者在手术前签署本项目知情同意书。

1.2 方法全部患者标本均为术中手术切取获得。其中胃癌组织标本115例，为癌组织中心部位切取，均经病理证实，作为观察组。同时切取距癌症组织5 cm以上的癌旁正常组织作为对照组，上述组织经HE染色确定为正常组织。手术标本在切取后立即放入液氮保存并转运至-80℃冰柜。RNA提取采用TIANDZ(天恩泽)试剂盒，自备氯仿，提取步骤根据TIANDZ说明书进行。NanoDrop2000 超微量分光光度计进行RNA浓度及纯度的检测，纯度OD260/OD280选择在1.8-2.0之间的RNA。

RNA逆转录为cDNA采用All In One cDNA逆转录试剂盒，逆转录过程严格按照All In One cDNA试剂盒说明书进行，逆转录所用RNA量为1 μl，总反应体系13 μl。反应条件为60℃10 min，4℃5 min。逆转录的cDNA放在冰中保存并进行下一步反应。

实时定量PCR:操作仪器为ABI公司生产的7500 Real time PCR机器，采用ABI公司生产的配套96孔PCR板，反应体系为20 μl，采用All In One PCR试剂盒。因为根据Primer-primer设计并由华大基因公司设计，具体序列见表1，反应条件为:95 ℃ 10 min;95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 cycles；95℃15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。每组样品均设3 个重复。

表1 荧光定量引物表

2 结果

将胃癌和癌旁组织的128个下调表达和673上调表达的基因进行火山图绘制，见图1。在115例胃癌患者组织标本中，HOTAIR 均在癌细胞组织中表达，诊断阳性率达100%。RT-PCR检测结果发现HOTAIR在观察组(4.58±0.92)和对照组(0.51±0.42)之间呈现差异性高表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

HOTAIR高表达和肿瘤大小及分化程度相关，而和年龄及性别无关，见表2。

Kaplan Meier曲线显示HOTAIR高表达病人预后较低表达病人预后差，(P<0.05)，见图3。

图1 胃癌组织与癌旁组织差异表达基因火山图

图2 RT-pcr检测HOTAIR在胃癌及癌旁组织的表达量

3 讨论

胃癌作为消化道最常见的恶性肿瘤，占我国肿瘤死亡率的第二位[5]，主要是因为缺乏有效的早期检查手段。大部分患者就诊时已为进展期胃癌。胃镜作为胃癌的主要诊断方法因在检查过程中患者感到疼痛而无法用于广泛普查。肿瘤血清标志物虽然对胃癌有一定的提示作用，但其缺乏准确性和特异性也无法对胃癌进行早期的诊断。故有效的简单、快捷并且特异性和准确性高的检验方法迫在眉睫。

表2 胃癌组织中HOTAIR 表达量与临床病理参数的关系

*P<0.05

图3 Kaplan Meier曲线显示HOTAIR高表达病人预后

近年来，长链非编码RNA[6]逐渐被发现在肿瘤的发生和发展中起到关键作用。其是一种长度大于200个核苷酸的不具备编码功能的RNA，早期被认为是转录过程中的“噪音”，而现研究显示其在许多疾病特别是肿瘤疾病中呈现异常的表达并参与肿瘤细胞的发生、进展、转移及耐药过程。其是通过基因印记、染色质修饰、转录前调控等作用参与到蛋白质的最终表达从而发挥调控作用。而且此种非编码RNA在血清中稳定存在[7]，故可能成为肿瘤及某些疾病的血清学标志物。和既往研究的编码蛋白基因相似，其也分为促癌基因和抑癌基因，其中HOTAIR即是一种促癌基因。先前研究证实，HOTAIR在胃癌组织和正常组织中差异性表达[8]，预示其可能成为胃癌诊断的潜在血清学标志物，但尚未进行大样本验证。故本文通过验证HOTAIR是否在全部胃癌患者中差异性表达，并推论其在远期生存率的诊断价值。

通过RT-PCR对全部胃癌组织及癌旁组织提取的RNA进行反转录和扩增后发现，HOTAIR在全部胃癌组织中均呈现高表达，且差异有统计学意义，说明胃癌患者HOTAIR高表达阳性率达到100%，具备潜在肿瘤标志物检测标准，和诸多研究结果相似[4,8]。文中19例I期胃癌患者组织中HOTAIR表达依然和正常癌旁细胞呈现差异性表达，说明HOTAIR可作为胃癌诊断的早期肿瘤学标志物。进一步对差异显著的HOTAIR进行细分，验证高表达和低表达HOTAIR对胃癌患者肿瘤参数的诊断价值发现，高表达的HOTAIR和肿瘤大小及分化程度相关，差异有统计学意义。说明HOTAIR和肿瘤的发生发展过程相一致，侧面说明HOTAIR在肿瘤早期即开始表达并随着肿瘤的发展逐渐呈现增高趋势。通过生存曲线分析发现HOTAIR高表达患者5年生存率明显低于低表达患者，原因和上述分析相似，即HOTAIR表达越高说明肿瘤发生发展时间较长，更有可能出现转移，说明HOTAIR表达水平对胃癌的预后具备诊断价值。

总之，通过对大样本的验证发现HOTAIR在胃癌组织中呈现高表达，对胃癌患者具备早期诊断价值。而且HOTAIR和胃癌患者肿瘤大小及分化程度及5年生存率相关，对胃癌患者的患病时间及远期生存率均有诊断价值。