BRAFV600E免疫组化在甲状腺乳头状癌中的表达及与临床病理特征的相关性研究

周 迪，刘 霞，丁国楠*，姜 瑛，马 丽

(1.吉林大学第二医院 甲状腺外科，吉林 长春130041; 2.青岛市市南区八大湖街道巢湖社区 卫生服务中心，山东 青岛266000)

近年来，甲状腺癌的发病率逐年升高，超声及影像学技术的广泛应用和细针抽吸活检的普及是导致这一发病率上升的部分原因。其中甲状腺乳头状癌约占甲状腺癌的85%[1]，是最常见的内分泌肿瘤，腺叶切除术或甲状腺全切除术加I131治疗是常规的治疗方式，但大约10%的PTC患者存在复发、淋巴结或远处转移，因此需要进一步干预。BRAF基因突变是近年来PTC诊断的主要发展方向。人们对BRAF基因突变认识的深入得益于聚合酶链反应(RT-PCR)、Sanger测序等基因检测技术、免疫组织化学(IHC)检测技术的不断提高。其对于甲状腺癌，尤其是在提高PTC的诊断率，实施个体化治疗，评估PTC的发生、发展和不良临床病理特征相关性方面尤为重要。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取本院2017年8月-2018年3月间收治的154例甲状腺肿物患者，所有患者均具备手术指征，给予甲状腺全切/次全切除术、颈部中央区淋巴结清扫术。甲状腺乳头状癌患者89例，结节性甲状腺肿患者40例，桥本氏甲状腺炎患者25例。其中89例甲状腺癌患者中男性为20例、女性为69例，男女比例为1:3，年龄在19岁-67岁，平均年龄43岁。

1.2 主要试剂及检测方法

1.2.1主要试剂 所用鼠抗人CK19、Galectin-3、HBME-1单克隆抗体(即用型)以及BRAF基因突变检测试剂盒(Ventana免疫组化增强扩增试剂盒)。美国 ventanae Bnch Mark ⑧x T 全自动免疫组化染色仪。

1.2.2免疫组织化学法检测 标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片(3 μm)及常规的 HE染色。利用美国 ventanae Bnch Mark ⑧x T 全自动免疫组化染色仪及Ventana免疫组化增强扩增试剂盒，对 CK19、Galectin-3、HBME-1进行免疫标记，检测154名甲状腺肿物患者的CK19、Galectin-3、HBME-1蛋白表达水平。具体的实验步骤按照操作步骤说明书进行，经过一系列的抗原修复、显色、染色操作后，用中性树脂封片，在显微镜下观察实验切片的染色情况。

1.2.3PCR法及DNA测序法检测 分别检测89例甲状腺乳头状癌患者、40例结节性甲状腺肿患者、25例桥本氏甲状腺炎患者BRAFV600E基因基因突变。选择各组患者手术标本组织的HE切片，连续切4 μm厚白片，封存于EP管，二甲苯处理，蛋白酶K完全消化，严格依照DNA提取试剂盒说明书提取石蜡组织标本DNA。应用BRAF基因突变检测试剂盒在自动化基因分析仪进行测序。采用电脑软件分析测序结果。

1.3 统计学分析所有数据整理后采用SPSS19.0统计软件进行分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同甲状腺肿瘤组织中BRAFV600E、CK19、HBME-1、G-3的表达

89例甲状腺乳头状癌中基因突变率为78.61%(70/89)，CK19在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、桥本氏甲状腺炎中表达率分别91.01%(81/89)、17.50%(7/40)、12.00%(3/25)，HBME-1在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、桥本氏甲状腺炎中表达率分别为75.28%(67/89)、12.50%(5/40)、16.00%(4/25),Galectin-3在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、桥本氏甲状腺炎中表达率分别为87.64%(78/89)、15.00%(6/40)、20.00%(5/25)。由此可见，BRAFV600E、CK19、HBME-1、Galectin-3在甲状腺乳头状癌中表达率明显高于结节性甲状腺肿、桥本氏甲状腺炎，结果见表1。

2.2 甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变与临床病理特征的关系

通过对比甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变与患者的性别、年龄、病灶直径、是否侵犯被膜、有无颈部中央区淋巴结转移、单灶或多灶病理学特征，发现甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变与是否侵犯被膜存在相关性(χ2=6.701，P<0.01)，而与性别、年龄、病灶直径、有无颈部中央区淋巴结转移、单灶或多灶无明显相关性(P>0.05)，结果见表2。

表2 89例甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变与临床病理特征的关系

3 讨论

BRAF基因突变是甲状腺癌中最常见的致癌突变[2]。BRAF是RAF家族的丝氨酸/苏氨酸激酶。RAF蛋白是RAF-MEK-ERK途径[丝裂原活化蛋白(MAP)/细胞外信号调节激酶(ERK)]的一部分，是真核生物中高度保守信号转导通路。RAS是RAF的上游激活蛋白，通过与GTP结合而呈活化状态，进而激活RAF蛋白，使MEK磷酸化并激活ERK[3]。而BRAFV600E指第15号外显子第1799位(T1799A)的核苷酸发生胸腺嘧啶到腺嘌呤的转换，导致在残基600位(V600E)上谷氨酸取代了原本的缬氨酸，甲状腺癌中BRAF突变大于92%是该种类型[4]。研究表明BRAFV600E基因突变绝大多数见于甲状腺乳头状癌[5]，其在甲状腺良性病变中仅少量表达或不表达，当然不同研究的略微差异可能与地域、及样本量有关。在本研究中发现BRAFV600E在甲状腺乳头状癌中表达率明显高于结节性甲状腺肿及桥本氏甲状腺炎。得益于BRAFV600E基因突变在甲状腺乳头状癌中较高的检出率，越来越多的国内外专家推荐甲状腺超声引导下穿刺细胞学检查联合BRAFV600E基因突变检测。相关研究也表明结果诊断率高达90%[6]。

此外BRAF基因突变影响细胞增殖、抑制分化和凋亡。换句话说，BRAF基因突变突变细胞失去正常细胞周期，从而引发恶性肿瘤的发生发展。因此在PTC中，BRAF基因突变被认为是肿瘤复发和预后差的危险因素，并且与肿瘤发病机制相关[7]。

CK19是一种低分子量的细胞角蛋白，是上皮细胞中的一种中间丝蛋白，广泛存在于单纯性和复杂性上皮细胞以及某些癌组织中。Song Q等人在研究中发现CK19在甲状腺乳头状癌中高表达，而在良性病变中不表达，因此指出CK19对甲状腺乳头状癌的诊断有很高价值[8]。在Lamba Saini M的研究中，CK19在甲状腺乳头状癌中的表达率为84-100%，甲状腺微小乳头状癌为59-84%，结节性甲状腺肿为26.8%，桥本氏病为20%[9]。本研究中CK19在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、桥本甲状腺炎中表达率分别91.01%(81/89)、17.50%(7/40)、12.00%(3/25)，同样表明其在甲状腺乳头状癌中的表达率明显高于另外两种良性病变。

HBME-1 为酸性氨基酸多聚糖蛋白， 是间皮细胞表面微绒毛的一种抗原成分。Prasad 等通过204例甲状腺病理组织分析得出HBME-1的表达对于鉴别高分化甲状腺癌与甲状腺良性肿瘤意义重大[10]。近年来国内相关研究也得出同样结论，研究指出HBME-1 在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率为92.5%，在良性病变中几乎不表达[11]。本研究中HBME-1在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、桥本甲状腺炎中表达率分别为75.28%(67/89)、12.50%(5/40)、16.00%(4/25)。综合诸多研究可见HBME-1主要表达于甲状腺恶性肿瘤，在甲状腺良性肿瘤中仅少量表达。

Galectin-3 是一种β-半乳糖苷结合凝集素，在甲状腺癌等多种肿瘤的转移、血管生成、增殖和凋亡中发挥作用[12]。通过与特异性配体结合，调控甲状腺癌细胞的增殖、凋亡、粘附、浸润、转移等生物学行为。相关研究表明， Galectin-3在甲状腺乳头状癌中的表达率为64.9-100%，在甲状腺微小乳头状癌中的表达率为45.7-98.0%，在结节性甲状腺肿中的表达率为0-52.6%，在桥本氏病中的表达率为19.0-38.9%[9]。在本研究中Galectin-3在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、桥本甲状腺炎中表达率分别为87.64%(78/89)、15.00%(6/40)、20.00%(5/25)。

由于CK19、HBME-1及Galectin-3在甲状腺乳头状癌中的高表达率，已成为一组甲状腺乳头状癌免疫组化检测的重要指标。结合免疫组化检测及基因突变检测，对于提高PTC 的诊断率意义重大。Qiu等人将免疫组化与RT-PCR和Sanger测序进行了比较[13]。Jung等人将免疫组化与RT-PCR和BRAF RNA原位杂交进行比较[14]。结合两组研究看出，BRAFV600E免疫组化的灵敏度和特异性范围分别为89%-100%和61%-100%。此外国内最新研究通过对62例甲状腺癌患者组织和62例甲状腺良性病变组织的免疫组化结果及BRAFV600E突变情况结合分析指出甲状腺乳头状癌相关免疫组化表达与BRAFV600E突变呈明显正相关[15]。但CK 19、HBME-1及Galectin-3与甲状腺乳头状癌临床病理特征相关性研究较少，仍需大量临床资料归纳总结。

国内外大量研究资料均指出BRAFV600E基因检测在提高甲状腺超声引导下细针穿刺细胞学检查准确率方面的积极作用。同时结合本研究及国内外相关研究也发现BRAFV600E基因检测联合某些蛋白免疫组化检查对于提高甲状腺乳头状癌的诊断意义重大。

此外甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变与其临床特征的相关性也是国内外众多学者关注的方向。通过分析BRAFV600E基因突变和临床病理特征之间的关联我们发现，BRAFV600E基因突变与患者的年龄和性别无关。Wang等人的大规模meta-analysis 分析也表明BRAFV600E基因突变与患者的年龄和性别无相关性[16]。本研究中发现甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变与被膜浸润有关，差异有统计学意义(P<0.05)。与性别、年龄、肿瘤直径、颈部中央区淋巴结转移、癌灶数量无关(P>0.05)。但也有相关国内外文献指出BRAFV600E突变与较高的病理学分期、淋巴浸润、神经浸润、肿瘤包膜缺失、甲状腺外扩散和甲状腺内扩散有关。Frasca 等人通过对甲状腺癌高危因素的分析，指出BRAFV600E基因突变仍然是影响肿瘤腺外侵及、淋巴结转移和较高病理分期的独立因素。BRAFV600E突变与预后不良的关系在Kim TH、Liu X等人的不同Meta分析也给予相似的结论[16]，说明BRAFV600E基因突变的PTC更易呈多灶性表现，更易发生甲状腺腺外浸润和淋巴结转移，具有较高的临床分期。但也有相关的研究给出了不同的结论，这可能于实验技术、医疗水平等因素有关。Pelttari等人发现[17]随着随访时间的延长，BRAFV600E突变与淋巴结转移和/或复发无关。Nam JK等人的研究也指出BRAFV600E突变与PMCs复发无关[18]。Zheng等人研究发现BRAFV600E突变与淋巴结转移无明显相关性[19]。

尽管BARFV600E基因突变作为PTC预后独立危险因素存在争议，但其仍考虑是甲状腺乳头状癌发生、发展以及影响预后的因素之一。实际的临床工作中，对于甲状腺乳头状癌患者，也应综合评估其流行病学特征，临床病理学特征以及遗传改变，综合评估预后，给予更精确的个性化治疗。