过氧化氢酶-2能力验证样品的制备及其 均一性和稳定性测定

魏 杰 王 洪 贾松华 岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

随着实验室认可制度的发展和实验室质量意识的不断提升，作为实验室评定重要部分的能力验证也在迅速发展；而加速这一发展的，正是中国合格评定国家认可委员会于2002年启动的能力验证提供者(PTP)认可计划[1-2]。能力验证提供者计划的实施，不仅能增强参与实验室对提供者的信任，也为计划的有效性、结果的承认与利用起到了积极作用。

对于提供者的认可，需要考察管理、技术等多方面因素来保证项目的顺利实施。而技术核心与出现问题的集中要素都是试样的均匀性与稳定性[2-3]。

中国食品药品检定研究院2015年在北京率先通过了实验动物检测项目的PTP认可，并组织全国范围的实验动物检测的能力验证活动。为满足能力验证认可要求，保障能力验证计划的顺利进行，本文即对2018年项目“NIFDC-PT -171实验小鼠肾匀浆中过氧化氢酶-2的检测”样品制备中的均匀性和稳定性进行研究，并对近几年样品制备工作进行回顾，为样品的研制发放提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 动物来源

a型BALB/c小鼠20只，8周龄，来自中国食品药品检定研究院；b型C3H小鼠20只，8周龄，来自北京维通利华实验动物技术有限公司。生产许可证号分别是SYXK(京)2017-0013和SCXK(京)2016-0011。

1.2 仪器

海尔BCD冰箱，THERMO恒温箱，Sartorius酸度计，ML4002电子天平，DY89-1匀浆机，HITACHI低温离心机，LABCONACO冻干机，BIO-RAD电泳仪。

1.3 试剂和耗材

7 mL无菌离心管，灭菌手术器械(剪刀，镊子，解剖板)，冰袋， CORNINIG冻存管，稳定保护剂、乙酸纤维素薄膜，三羟甲基氨基甲烷，柠檬酸、过氧化氢酶-2染色试剂盒。

1.4 标准样品的制备[4]及均匀性测定程序

1.4.1观察动物外观及编号；

1.4.2二氧化碳安乐死处理，解剖小鼠取肾脏，剥除脂肪等附着物。

1.4.3按照品系，分别称取BALB/c、C3H小鼠肾脏总质量。

1.4.4按照W(肾)∶V(水)=1∶2的比例，分别向装有BALB/c、C3H肾脏的2支管中加入蒸馏水，用匀浆机匀浆。

1.4.5配平后置于离心机中离心匀浆液。15 000 r/min离心30 min，分别分离上清入新管，得到a型和b型肾匀浆各1份(BALB/c及C3H分别为a、b型)。

1.4.6分别向2新管中加入一定比例的稳定保护剂混匀，分装至冻存管中，置于冻干机中冻干。共制得a型样品112瓶，b型样品84瓶。-20 ℃冻存待检。各样品取出实验时均需加入70 μL水还原后使用。

1.5 样品的均匀性测定

1.5.1按照4%的比例随机抽取a、b型样品试样，还原于微量加样器加样。醋纤膜点样电泳、染色，并判读条带。具体实验条件及判定标准参见GB/T 14927.1—2008过氧化氢酶-2项目[4]。

1.5.2如所得a型条带和b型条带均清晰可读，且与标准规定一致，即认为符合样品的均匀性要求。如未通过均匀性检测，则需重新制样并检测，直到符合标准规定。

1.6 样品的稳定性测定

1.6.1冻融稳定性:a、b型样品试样各取3管，首次测定于-20 ℃冰箱中取出加水还原测定。实验条件同1.5.1。如所得条带清晰可读且与标准一致，则认为1次冻融稳定性良好。初次冻融后，即将试样放入-20 ℃冰箱冷冻，每隔2 h再次取出，融化点样测定。结果判读依据与初次相同。如过程中发生拖带、弥散等情况，终止冻融测定并记录测定次数。如过程中一直稳定，也以4次冻融为测定终点。

1.6.2时间-温度稳定性

1.6.2.1 制作一个测试计划表，拟定放置的时间和温度。分别将时间和温度设为观测的横、纵坐标，设定4、20、37 ℃这3个温度观测点，1、2、3、7、15、30 d为观测时间，在每个坐标交点，每个型别的样品分别随机抽取2瓶进行编号。

1.6.2.2 编号规则。标记顺序为：时间-温度-型别。如4 ℃存放a型1 d样品标记为“1-4-a1”、“1-4-a2”，b型37 ℃存放4 d样品标记为“4-37-b1”、“4-37-b2”，等。

1.6.2.3 在取出日期，进行稳定性的检测。如所得条带清晰可读且与标准一致，则认为该温度时间坐标点稳定性良好。如所得条带中任何1条发生条带模糊不可读，则认为在该坐标点已经发生了样品的稳定性变化，记录不稳定坐标点。且当不稳定点出现后，其之后的时间温度观测点随之取消。但即使一直稳定，本测定的观测周期也仅为30 d时长。

1.6.3汇总各型别稳定性结果，填写时间温度稳定性表格。稳定用“○”表示，不稳定用“×”表示。

2 结果

2.1 均匀性测定结果

本次抽样按照小样本4%的比例抽取了过氧化氢酶-2标准样品a型4管、b型3管[4]。经过两次重复电泳染色所得结果一致，表现为100%a型和100%b型，见图1。

图1 过氧化氢酶-2均匀性抽样结果图注：1～9分别为a1、a2、a3、a4、标准a、标准b、b1、b2、b3Fig.1 Sampling results of catalase-2 uniformityNote: 1～9 shows a1,a2,a3,a4,standard a,standard b,b1,b2,b3 respectively

2.2 冻融稳定性结果

经检验，冻融1～4次的a、b型过氧化氢酶-2样品均表现稳定，所制样品的冻融稳定性良好，见图2。

图2 过氧化氢酶-2四次冻融稳定性结果图注：F1～F4分别代表1～4次冻融；每组的1～3均为a型，4为标准a，5为标准b，6～8为b型。Fig.2 4-time freeze thawing stability results of catalase-2Note: F1～F4 show the first to forth freeze thawing test results; number1 to 3 are the a type samples results, 4 and 5 are standard a and standard b results respectively, and 6 to 8 are the b type samples results.

2.3 时间-温度稳定性测定结果

a型及b型标准样品在4 ℃、20 ℃和37 ℃条件下均可稳定存放至30 d，不同个体之间没有显著差异，不同型别之间没有显著差异，见表1。

当然，温度对酶的活性强度仍存在一定影响。4 ℃及室温条件下，样品表观颜色基本没有改变且电泳后染料着色度高。37 ℃条件下，样品的表观颜色变深，电泳后虽能分辨带型，但染料着色度降低。图3给出了b型样品37 ℃存放1～30 d的加样和染色结果。

表1 过氧化氢酶-2样品不同温度时间稳定性结果Table 1 Results of catalase-2 stability under different time and temperature condition

注：“○”表示样品稳定

Note: “○”means stable

图3 过氧化氢酶-2 b型37℃30 d稳定性结果图注：1～16分别表示1-37-b1,1-37-b2,2-37-b1,2-37-b2,标准b,标准a,3-37-b1,3-37-b2,7-37-b1,7-37-b2,标准a,标准b,15-37-b1,15-37-b2,30-37-b1,30-37-b2Fig.3 30-day stability results of b type catalase-2 at 37 ℃Note: 1～16 shows 1-37-b1,1-37-b2,2-37-b1,2-37-b2,standard b, standard a,3-37-b1,3-37-b2,7-37-b1,7-37-b2,standard a,standard b,15-37-b1,15-37-b2,30-37-b1,30-37-b2 respectively

3 讨论

3.1 过氧化氢酶与动物选择

过氧化氢酶是一类存在于动植物及微生物体内的末端氧化酶，其同工酶在物种和组织特异性鉴别、药物毒物等损伤评价等方面有着广泛的应用[5-7]。不同来源的过氧化氢酶的特点存在差异，就小鼠而言，过氧化氢酶在肝、肾组织中更为丰富，且1～4月龄的小鼠过氧化氢酶活性与年龄无明显相关性，大于4月龄后随年龄增长酶活性降低[8]。我们在选择动物时使用了2月龄的小鼠，考虑了这一特点，同时兼顾了饲养购买成本。

3.2 样品的型别设计方案

过氧化氢酶-2是国标GB/T14927.1—2008中近交系小鼠检测常规项目之一，其常见带型为快带a型和慢带b型[4]。在之前的样品制备中，我们曾做过酯酶-3的杂合型样品，并通过了均匀性和稳定性验证，对于实际检测也有杂合型的判读应用[9]。然而，基于文献对于过氧化氢酶-2杂合型容易误判的研究，本研究仅设定了快带a型、慢带b型两个容易判读型别[10]。通过应用标准品比对条带泳动速度的快慢，进行定性判断。

3.3 样品稳定性方案设计

样品从制备到发放需经历存储、运输、实验等环节，温度、时间等因素都会对其品质产生影响。在近几年的样品制备中，我们曾研究过-20、4、20 ℃和37 ℃温度坐标以及1～90 d时间坐标的存放稳定性，而对于冻融稳定性研究较少[9,11]。由于采用冷链运输，温度在运输过程中基本可控。但就近两年快递样品代签收的情况，使得部分样品存在冻融状态。为此，在过氧化氢酶-2样品的制备过程中，我们加强了冻融稳定性研究，共测定了4次冻融结果，其稳定性较好。

生化标记电泳检测是国家标准规定的近交系大、小鼠遗传质量监测方法，也是目前进行近交系小鼠遗传质量检测的有效方法[12]。但目前所有生化标记检测项目均为定性项目，只能依据电泳快慢进行型别判读，以及通过条带有或无进行稳定性的判断。通过相关研究，我们发现过氧化氢酶在常温下稳定性较好，可以在25 ℃条件下稳定存在3个月[13]，而我们通常在1个月以内就会完成发放到结果回收。因此时间长度设定在30 d以内，温度上也贴合运输和实验中可能存在的温度范围，选择了4、20 ℃和37 ℃进行样品的测定。经测定，在已知的小鼠生化标记样品中，过氧化氢酶-2在37 ℃稳定性最佳(酯酶-3和肽酶-1在37 ℃仅能稳定存在1 d[9,11])，30 d的样品虽然表观有变色，仍可检测出相应的带型。即能在37 ℃稳定存在30 d，更适于作为样品满足能力验证项目的需求。