Ⅰ型干扰素受体(Ifnar)基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

陈亚坤 孙 婧 蒋亚君 王昕昉 刘晓宇 戴连攀 卢选成 李晓燕

(1. 中国疾病预防控制中心，北京 102206)(2. 中科院北京生命科学研究院，北京 100101)

干扰素(Interferon，IFN)是能够干扰病毒在宿主细胞内增殖的一种蛋白，1957年由Isaacs与Lindenmann共同发现。干扰素分为I型干扰素和Ⅱ型干扰素两大类[1]。I型干扰素包括IFN-α和IFN-β，Ⅱ型干扰素也称为IFN-γ[2]。干扰素生物效应发挥的前提是，必须要与细胞表面相应的信号受体结合[2-3], 如果干扰素受体缺乏，会导致干扰素无法与之结合，进而无法发挥干扰素的生物学效应。干扰素受体(IFNR)分为I型干扰素受体(结合I型干扰素)和Ⅱ型干扰素受体(结合Ⅱ型干扰素)，干扰素受体基因敲除小鼠属于免疫缺陷动物模型，是多种病毒研究的敏感动物模型，可用于病毒的致病机制研究以及抗病毒疫苗、药物研发。中国疾病预防控制中心实验动物中心通过引进I型干扰素受体(Ifnar)基因敲除小鼠，并在负压屏障设施内以1雄2雌的合笼方式进行了饲养、保种繁育，并对繁育的仔鼠基因型进行了鉴定，结果获得了稳定的ifnar-/-基因型小鼠。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Ifnar基因敲除小鼠纯合子自重庆医科大学引进，品系名：B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax， 遗传背景：C57BL/6，基因型：ifnar-/-。

1.2 仪器和试剂

PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司，型号：TC-XP-D)，化学发光凝胶成像系统(北京科创锐新生物科技有限公司，型号：K8360)，核酸水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司， 型号：DYCP-31DN)，台式高速冷冻离心机(艾本德中国，MiniSpin)，恒温水浴锅(上海习仁，型号：HH-12)，实验动物饮水机(北京木牛流马精华工程技术有限公司， MN-LM200 J)；动物饮水专用灭菌器(凌云博际北京科技有限公司，Ⅲ型)。

基因组DNA提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司， 货号：EE101)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限公司， 货号： AS111)，2 K DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司，货号：BM101)， Biotium Gelred核酸染料(10000×)(莱博斯特(北京)科技有限公司，货号：41003)。

1.3 Ifnar基因敲除小鼠的饲养繁育

Ifnar基因敲除小鼠饲养在中国疾病预防控制中心实验动物中心负压屏障设施内[4], 在独立通风笼盒(individually ventilated cages，IVC)内饲养和繁殖，饲养温度控制在20～24 ℃，相对湿度40%～70%，自由饮食进水，昼夜光照节律。按照SPF级动物饲养标准进行饲养，垫料、鼠盒均经过131 ℃、15 min 高压蒸汽灭菌后使用。饲料采用华阜康公司生产的SPF级小鼠饲料,小鼠饮水采用超滤净化水机生产后再高压灭菌处理。垫料每周更换1次,每日补充充足饲料及饮水。采用1雄2雌合笼方式进行繁殖。

对14笼合笼的纯合Ifnar基因敲除小鼠(5～10个月月龄)的生产情况进行4个月的跟踪，对生产的仔鼠数量进行统计计算。

1.4 小鼠的基因型鉴定

1.4.1鼠尾基因组DNA提取:剪取小鼠尾尖长0.2～0.3 cm的组织，放入容量1.5 mL离心管中，快速放入-20 ℃保存。用DNA提取试剂盒提取小鼠基因组DNA后，放于4 ℃备用。

1.4.2PCR扩增反应:鉴定引物序列由上海生工生物工程技术服务股份有限公司合成， Common：CGAGGCGAAGTGGTTAAAAG, Wild type Reverse：ACGGATCAACCTCATTCCAC, Mutant Reverse：AATTCGCCAATGACAAGACG。以上3种引物按照1∶1∶1比例混合至10 μmol/L，进行PCR反应。PCR反应体系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，引物混合物 1 μL，模板DNA 2 μL，灭菌ddH2O 7 μL。采用PCR扩增仪进行Touchdown循环扩增，反应条件：预变性94 ℃ 2min；变性94 ℃ 20 s，复性65 ℃ 15 s，复性温度每个循环下降0.5 ℃，延伸68 ℃ 10 s，循环10次；变性94 ℃ 15 s；复性60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 10 s，循环28次；最后延伸72 ℃ 2 min；10 ℃停留。最后样品取出,4 ℃保存备用。

1.4.3琼脂糖凝胶电泳:取PCR扩增产物1 μL，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳分析，以120v由负极向正极电泳30 min，于化学发光凝胶成像系统中拍照观察。

1.4.4基因型结果判定:按条带不同鉴别出各个基因型小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳基因型片段为:Common和 mutant reverse 引物扩增产物长度为250 bp左右，为突变型(KO)小鼠；Common和 Wild type reverse引物扩增产物长度为155 bp左右,为野生型(WT)小鼠；250 bp和155 bp两条电泳条带均存在的为杂合(HET)小鼠。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 小鼠外形特征

C57BL/6(=B6)遗传背景的Ifnar基因敲除小鼠成年鼠的被毛为黑色，与野生型B6小鼠相同。Infar基因敲除小鼠交配后产生的子代新生幼鼠, 两眼紧闭，四肢蜷缩，皮肤无毛，呈肉红色,与野生型幼鼠外观形态上无明显差异。

图1 基因敲除小鼠的成年鼠和仔鼠外形特征注：A.成年小鼠 B.1日龄仔鼠Fig.1 Appearance of adult and neonatal knockout miceNote：A. adult mouse B. neonatal mice

2.2 小鼠的繁育情况

Ifnar基因敲除母鼠妊娠期为20 d左右，哺乳期为21 d左右，小鼠的性成熟期为45～60 d，以上小鼠生理特性和野生型无明显差异。但在产仔数量上，大多在每胎10只以下，较野生型每胎8～15只低。对14笼5～10个月月龄小鼠的生产情况进行4个月的跟踪，对生产的仔鼠数量进行统计计算。在4个月期间14笼小鼠共计生产41胎， 产仔数量总数为225只，平均每胎为(5.6±2.7)只，和野生型理论值每胎8～15只相比较，差异极显著(P﹤0.01)，具有统计学意义。

2.3 小鼠基因型鉴定结果

部分小鼠鼠尾基因组DNA扩增产物鉴定结果如下图：N为阴性水对照，未见条带。1号样品条带在155 bp位置左右，为野生型，2～8号样品条带在250 bp位置左右，为I型干扰素受体(ifnar)基因敲除小鼠。

图2 部分小鼠PCR基因型鉴定结果注：M:Marker(2 kb DNA marker)1：野生型样品 2～8：不同样品 N:阴性对照Fig.2 Results of genotype identification of some mice by PCRNote: M:Marker(2 kb DNA marker)1:wild type 2～8: Different samples N: Negative control

3 讨论

在敲除小鼠的饲养过程中，其外观形态、性成熟时间、妊娠时间，哺乳时间等，与野生型小鼠相比未见明显差异。但在产仔数量上，敲除小鼠(5.6±2.7)只明显较野生型每胎产仔数量少，和理论值每胎8～15个存在极显著差异。当然,不排除饲养条件,环境因素等对小鼠的生殖能力造成影响,但经观察,同等条件下本中心其他小鼠具有和理论值相当的生殖能力。并且本研究中产仔数量的差异与王晓东等[6]的实验结果相一致，他们对三种品系的基因敲除小鼠产仔数量进行研究，结果表明，三种基因敲除小鼠平均每胎产仔数量与其背景小鼠相比均低，其中II型干扰素受体基因敲除小鼠平均每胎产仔数为(5.25±0.82)只。因此综合以上结果推测，某些基因的敲除可能会影响敲除小鼠的繁殖能力。本研究中Ifnar敲除小鼠产仔能力较低，可能是由于I型干扰素受体基因的敲除影响了某些基因的调控表达，使敲除小鼠的某些功能丧失，造成生殖功能障碍。但这种差异是否确实与基因敲除有关，还需要进一步研究。

基因敲除小鼠繁育保种的一个重要环节就是基因型鉴定，方法主要包括PCR法和传统的Southern bolt法[7]。本研究采用试剂盒提取鼠尾组织基因组DNA，参照Jackson Laboratory提供的引物序列，通过普通PCR扩增,凝胶电泳成功鉴定出Ifnar敲除鼠的基因型，与southern bolt鉴定法相比较，整个过程耗时较短、费用较低，该方法可以作为Ifnar基因敲除小鼠基因型检测的一种快速可靠方法。

1994年Müller 等首次成功制成Ifnar敲除小鼠[8],属于基因修饰的免疫缺陷小鼠模型。小鼠由于性格温顺易饲养，便于操作，繁殖能力强，且对病毒易感等特性，广泛应用于各种病毒致病机理以及疫苗和药物评价的研究。但是免疫功能健全的小鼠对有些病毒耐受,不能建立病毒感染模型或模型不利于后续病毒各项研究,免疫缺陷小鼠模型的建立就显得尤为重要。例如，用寨卡病毒感染免疫功能健全的C57B/6,BALB/C,CD1小鼠，组织中未检测到病毒RNA，小鼠也未出现疾病症状[9-11]。但Lazear等[12]用寨卡病毒接种Ifnar敲除小鼠，小鼠则高度易感，呈现后肢无力、瘫痪等典型的神经症状。因此，ifnar-/-免疫缺陷小鼠模型的建立和应用对某些特定病毒的研究至关重要。

目前，Ifnar敲除小鼠在人肠道病毒71 型(Enterovirus 71,EV71)[13-14]、登革热病毒(Dengue virus，DENV)[15]和寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)[16]等的研究中都有应用。近年来，随着zika病毒研究成为热点问题，对于干扰素受体敲除小鼠的应用也随之日益增加。但这些前期的研究中应用的干扰素受体敲除小鼠多为129背景,如 I型干扰素受体基因敲除的A129，II型干扰素受体基因敲除小鼠的G129，以及以上两种鼠杂交得到的AG129。基因敲除小鼠常见于129小鼠是因为其ES做打靶时，中靶效率高，囊胚注射后成功率也高。最初Zika病毒研究中，小鼠模型也多为129背景,但近来B6背景的Ifnar敲除小鼠模型也多有建立[12，17]。因为B6小鼠遗传背景和生理生化指标更清楚，当只有129背景品系小鼠时，可把129小鼠和B6小鼠回交，获得B6类似背景的小鼠，再进行试验。本实验中小鼠为129小鼠和B6小鼠回交后得到的B6背景Ifnar敲除小鼠。

为满足科学试验研究的需要，本中心引进B6背景的ifnar基因敲除小鼠，在负压屏障动物房饲养,通过一段时间的繁殖、鉴定，已获得一定数量的ifnar基因敲除小鼠，这为多种病毒的深入研究提供了一定的前期实验动物基础，并且相较于129品系的小鼠模型，遗传背景更清晰，生理生化指标更清楚，有助于得到重复性更好的实验结果。