精神依赖药物成瘾模型建立及小脑Bax基因的表达*

谢明仁 俞发荣

(甘肃政法大学 甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室， 兰州 730070)

精神依赖物质(海洛因)的滥用与造成机体所有系统器官的毒性损伤作用有关。从偶尔的喜好活动过渡到长期的滥用和成瘾，大多数成瘾者的复发，即使经过长时间的禁欲，几乎没有有效和确定的治疗机会[1]。精神依赖药物成瘾不但危害成瘾者自身的身心健康,还会造成严重的社会问题[2]。有关海洛因成瘾对大脑组织的损伤作用方面研究较多[3]，小脑与大脑、脑干和脊髓之间丰富的传入和传出联系，参与躯体平衡和肌肉张力(肌紧张)的调节，以及随意运动的协调。小脑损伤，机体的肌肉张力就会减退，随意运动的协调性出现紊乱。因此，为了探索小脑在精神依赖药物(海洛因)成瘾和戒断中的作用，建立精神依赖药物成瘾动物模型，为进一步研究精神依赖药物成瘾机制，为戒毒制定新的、有效的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：SPF级Wistar大鼠，由甘肃中医药大学科研实验中心提供,实验动物生产许可证号[SCXK (甘)2015—0001],实验在甘肃政法学院SPF级实验室进行，实验动物使用许可证号[SYXK (甘)2015—0006]。本实验所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》规定，按3R原则给予实验动物以人道关怀(伦理委员会审批号码:GZF—2018—003)。

海洛因：为白色粉末, 纯度为86.8%,由兰州市公安厅禁毒办提供，实验时用灭菌蒸馏水配成所需要的浓度。盐酸纳洛酮，北京四环医药科技股份有限公司生产,批号:1806152；大鼠凋亡因子Bax试剂盒、大鼠Caspase-9试剂盒、大鼠Caspase-3试剂盒，购于上海纪宁实业有限公司；MK3-酶标仪,上海仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1动物处理：取SPF级Wistar大鼠20只(雄性)，体质量185～190 g。全部动物在SPF级实验室IVC饲育盒饲养，自由饮食进水，明暗周期12 h，单笼饲养。动物房温度22～24 ℃，湿度55%～65%，适应7 d。动物随机分为2组,每组10只。对照组：肌肉注射生理盐水10 mL/kg，每天2次；海洛因组：给予海洛因、纳洛酮的方法、剂量以及持续时间均按文献[4]操作。第15天腹腔注射盐酸纳洛酮(纳洛酮是吗啡样物质受体特异拮抗剂，能迅速翻转吗啡作用，采用该药的目的为观察是否出现戒断症状，判断成瘾模型建成与否)，待观察完戒断症状后取样。

1.2.2取样：实验第15天，动物经乙醚吸入无痛麻醉，打开胸腔，从左心室推注生理盐水100 mL，冲去血液，用4%多聚甲醛-1.25%戊二醛磷酸缓冲液(pH7.4)灌注固定，剥取大鼠小脑皮层组织5 mg，研磨成匀浆，3 000 r/min离心20 min，取上清用,以标准物的浓度为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，在540 nm波长下，绘出标准曲线和标准曲线的直线回归方程。分别将大鼠小脑组织A值代入直线回归方程，计算出样品的浓度。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 成瘾大鼠戒断症状

按Maldonad法评分，给予盐酸纳洛酮1 h后, 大鼠出现扭体、湿狗样抖、咬牙,跳跃、站立、上睑下垂、清理毛发等戒断症状,成瘾动物模型建立成功，表1。

表1 海洛因成瘾戒断症状及评分标准Table 1 Heroin addiction withdrawal scoring criteria

注：与对照组比：**P<0.01

Note：compared with the control group：**P<0.01

2.2 海洛因对大鼠小脑组织Bax水平的影响

Bax标准曲线的直线回归方程为：Y=6.3×10-3x+1.4×10-2，R2=0.9979。将大鼠小脑组织吸光度(A)代入方程，成瘾大鼠小脑组织Bax水平比对照组升高了88.21%，图1。

图1 海洛因对大鼠小脑组织Bax水平的影响注：与对照组比：**P<0.01Fig.1 Effect of heroin on Bax level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group **P<0.01

2.3 海洛因对大鼠小脑组织Caspase-9水平的影响

Caspase-9标准曲线的直线回归方程为：Y=1.4×10-3x+4.43×10-2，R2=0.998。将大鼠小脑组织吸光度(A)代入方程，成瘾大鼠小脑组织Caspase-9水平比对照组升高了87.24%，图2。

图2 海洛因对大鼠小脑组织Caspase-9水平的影响注：与对照组比：**P<0.01Fig.2 Effect of heroin on Caspase-9 level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group： **P<0.01

2.4 海洛因对大鼠小脑组织Caspase-3水平的影响

Caspase-3标准曲线的直线回归方程为：Y=5.0×10-4x+5.2×10-3，R2=0.999。将大鼠小脑组织吸光度(A)代入方程，成瘾大鼠小脑组织Caspase-3水平比对照组升高了94.21%，图3。

图3 海洛因对大鼠小脑组织Caspase-3水平的影响注：与对照组比：**P<0.01Fig.3 Effect of heroin on Caspase-3 level in cerebellum tissue of ratsNote：compared with the control group： **P<0.01

3 讨论

海洛因成瘾者抑制控制功能受损是一种持久性的、不可逆的脑损伤[5], 海洛因成瘾致使大脑皮质下中枢灰质体积减少[6]。功能性磁共振成像(fMRI)研究证明，长期吸食海洛因的成瘾者大脑突显性网络功能连接异常增强[7]，从而引起脑默认网络结构连接和功能连接不同程度破坏[8]以及颌下腺神经内分泌功能异常[9]。Bax基因是一种促进细胞凋亡的基因。人类Bax基因定位于染色体19q13.3～19q13.4，含6个外显子，其C端含有疏水氨基酸组成的跨膜结构域，Bax蛋白为整合膜蛋白[10]。细胞线粒体内外膜之间的通透性转换孔(PTP)具有调节线粒体通透性的作用。正常情况下,PTP是关闭的。在凋亡诱导因素 Bax 作用下，线粒体跨膜电位降低，PTP开放,导致线粒体膜通透性增大,使细胞凋亡的启动因子如：细胞色素C,凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)和凋亡诱导因子(AIF)等从线粒体内释放出来。细胞色素C(Cytc)作为呼吸链中重要的电子传递体[11]，它从线粒体内膜上的释放阻断了电子向下游的传递，危及呼吸链的功能并导致超氧阴离子的加速产生，细胞色素C和Apaf相互作用可激活caspase-9,进而激活caspase-3,导致细胞凋亡。给予海洛因后，免疫组化实验结果发现，大鼠小脑皮质细胞中Bax阳性细胞数明显增多[4]，酶联免疫吸附法(ELISA)检测发现，大鼠小脑皮质细胞中Bax表达水平显著升高，caspase-9和caspase-3活性显著增强,与对照组比有显著性差异(P<0.01)，与前期实验结果相一致。免疫组化法和ELISA法检测结果相互验证实验结果。实验结果提示，海洛因成瘾不但与大脑神经中枢有关，而且小脑皮质也参与海洛因成瘾和戒断过程。海洛因可能通过诱导小脑皮质Bax基因表达，激活caspase-9和caspase-3,引起小脑皮质细胞凋亡，导致小脑皮质细胞的损伤。本文的实验结果为进一步研究精神依赖药物成瘾机制和戒毒治疗提供新的参考依据。