茶多酚的抗癌作用机制及EGCG纳米载体技术研究进展

张杨波,饶甜甜,刘仲华,3,*

(1.湖南农业大学教育部茶学重点实验室,湖南长沙 410128; 2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;3.湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128)

茶原产自中国,是一种风靡全球的饮料[1]。根据生产工艺,茶可分为六大类:绿茶、白茶、黄茶、红茶、乌龙茶和黑茶,加工方式的不同导致不同茶类化学成分存在差异[2]。茶多酚(Tea polyphenol,TP)是茶叶的主要功能成分,是30多种酚类化合物的总称[3]。最主要的是以儿茶素为代表的黄烷醇类物质,儿茶素是2-苯基苯并吡喃的衍生物,包括表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)和表儿茶素(Epicatechin,EC)等主要组分。EGCG是其中生物活性最高的,同时也是含量最多的儿茶素,占儿茶素总量的50%～70%[4]。研究表明,以EGCG为代表的茶多酚类物质具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗肥胖、保护心血管和预防糖尿病等多种保健功效[5]。

肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤,后者就是我们所说的癌症,癌症作为全球发病率和死亡率最高的病症之一,如何预防和治疗成为关注的焦点[6]。流行病学研究表明,每天饮茶(≥4杯)可以降低人类患上癌症的风险[7]。临床研究表明,经常喝茶能对胃内的恶性肿瘤起到抑制效果,揭示了茶多酚在恶性肿瘤中的辅助治疗作用[8]。大量的动物模型实验也证实了茶及茶多酚对癌症具有预防和治疗的作用[9]。EGCG的体外抗癌活性已被证实,然而因其生物利用度低,在现代治疗中的应用有限。在正常生理pH情况下,EGCG的稳定性较低,如何提高其稳定性是 EGCG 作为防癌治癌制品的关键之一,有研究表明通过向EGCG中添加生物分子对其稳定性没有明显提升效果[10]。相对于传统材料而言,纳米粒子作为一种新型材料,具有卓越的表面效应和尺寸效应,不仅能大幅度提高EGCG的稳定性,还能增加其生物利用率[11]。因此,纳米技术作为EGCG的载体成为人们关注的重点。

本文综述了茶多酚中主要成分EGCG在肿瘤防治中的抗癌机制,包括诱导细胞凋亡、抑制癌细胞转移和侵染、抑制血管生成、抗甲基化和抵御肿瘤治疗中的放射损伤等;为了提高EGCG在生物体中的稳定性与生物利用率,本文对纳米载体技术在EGCG中的应用进行了概述,为茶多酚的临床应用提供依据。

1 EGCG在肿瘤防治方面的机制研究

1.1 EGCG诱导细胞凋亡的作用机理

细胞凋亡是基因控制下的细胞自我消亡的过程,可以通过外部和内部途径启动。诱导肿瘤细胞凋亡是目前治疗肿瘤的重要研究方向,EGCG的诱导作用主要发生在癌细胞中,使细胞周期停滞于S-G2/M期,对人癌细胞的细胞毒性作用显著高于对人体正常细胞的作用[12-13]。研究表明在癌症发展的复杂过程中,持续的能量需求刺激了从头脂肪生成(DNL)通路的上调,DNL通路新合成的脂肪酸在癌细胞增殖、转移和抵抗细胞毒性状态中发挥重要作用,酶抑制靶向DNL通路被认为是治疗癌症的一种替代疗法[14]。Khiewkamrop等[15]采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法测定EGCG对HepG2细胞毒性的影响,其中EGCG处理后,DNL通路中乙酰辅酶A羧化酶(ACC合成酶)和脂肪酸合成酶蛋白(FASN)的表达水平分别下降了42%和51%左右,EGCG对HepG2癌细胞中DNL通路的抑制会降低对癌变有促进作用的肉碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)的活性,进一步证明,EGCG通过靶向抑制DNL通路中的关键酶来触发细胞凋亡。为了进一步了解其作用机制,Wang等[16]采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖和细胞毒性,EGCG表现出以剂量和时间依赖的方式诱导生长抑制和凋亡。EGCG在下调B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl2)的同时上调了Fas和Bax的mRNA表达,EGCG通过触发结构蛋白(Caspase)依赖性内源性(线粒体)和外源性(死亡受体)通路诱导B淋巴瘤细胞凋亡。田梦秋等[17]研究了包括EGCG在内的茶多酚(TP)对人喉癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响，用不同浓度的TP对Hep-2细胞进行处理，结果TP可抑制Hep-2细胞增殖,诱导其凋亡,同时上调了Caspase-3和BaxmRNA的表达,下调了Bcl2 mRNA的表达,呈剂量依赖性。

以上研究表明,茶多酚诱导细胞凋亡的作用机理可能是通过靶向抑制DNL通路中的关键酶;调节多种细胞信号通道,例如调节Caspase-3和BaxmRNA表达;抑制Bcl2 mRNA等多种途径实现。

1.2 EGCG抑制癌细胞转移和侵染的作用机理

肿瘤转移是指癌细胞脱离原发部位,侵入淋巴管或血管,在其他组织或器官继续生长的过程。抑制肿瘤的转移成为癌症治疗中的关键性[18]。黑色素瘤是最常见的皮肤癌和恶性黑色素瘤,TOLL样受体4(TLR4)在黑色素瘤中起着重要作用。Chen等[19]将黑素瘤细胞株(B16F10和A375)分别用TP和脂多糖(LPS)处理,结果表明TP明显对体内黑色素瘤(B16F10)的生长起到抑制作用,并呈现剂量依赖性和时间依赖性的特点。在Chen等[20]对EGCG体外治疗效果研究中,表明EGCG能够抑制肝癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,有效抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。此外EGCG处理导致人肝癌细胞中的促血管生长因子基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的下调。Fang等[21]给鼻咽癌异种移植小鼠口服EGCG,发现EGCG实验组中p53和p21的表达明显提高,最终通过Caspase 3激活导致鼻咽癌细胞凋亡。以上研究均表明EGCG可以抑制癌细胞的增殖和侵袭,揭示了以EGCG为主要成分的茶多酚可作为安全、有效的抗癌细胞转移药物成分。

EGCG抑制癌细胞转移和侵染的作用机理可能是通过抑制TLR4的表达进而抑制癌细胞功能(增殖、迁移、侵袭),或者通过抑制MMPs或细胞外信号调节激酶的活性来阻止肿瘤细胞的转移和侵染。

1.3 EGCG抑制血管生成的作用机理

血管生成是指从已有的毛细血管形成新的血管网络,在肿瘤的转移过程中起着关键性作用[22]。EGCG被证实有显著的抑制血管生成的作用能有效阻止肿瘤发生转移[23-24]。Li等[25]采用无血清培养基,培养人NSCLC(A549)细胞24 h,再用不同浓度的EGCG液预处理1 h,然后用胰岛素样生长因子(IGF-I)继续培养16 h。在体外和体内的实验中表明EGCG在10、25、50、100 μmol/L可以明显抑制IGF-I诱导的ECMatrix表面毛细管结构的形成,同时还降低了基质栓中血红蛋白水平。EGCG能抑制诱导IGF-I下调 HIF-1α蛋白质的表达,当浓度为25和100 μmol/L时有效影响诱导IGF-I VEGF表达,表明EGCG可通过抑制HIF-1α和VEGF表达进而抑制肿瘤血管生成,实现抗肿瘤作用。Jung[26]等通过体内研究法,在人胸腺BALB/c裸鼠皮下注射HT29细胞,并在肿瘤细胞接种后2 d开始每日腹腔注射EC(阴性对照)或EGCG(-1)。与对照组相比,EGCG有效抑制肿瘤生长(58%)、降低微血管密度(30%)、减少肿瘤细胞增殖(27%)、诱导肿瘤细胞凋亡(1.9倍)和内皮细胞凋亡(3倍)。

以上研究说明,EGCG抑制血管生成的作用机理可能是通过阻断VEGF的诱导来抑制血管生成,从而发挥部分抗癌作用。

1.4 EGCG在表象遗传修饰中的抗甲基化作用机理

表观遗传学是研究基因表达的可遗传变化,这种变化独立于原始DNA序列的变化。最近的研究表明,除了基因改变外,表观遗传畸变在产生癌症中起着重要的作用[27]。虽然DNA序列没有变化,但表观遗传变化包括DNA甲基化、组蛋白尾修饰和非编码RNA的影响。这些修饰主要是通过改变细胞的紧密性和对不同调节蛋白来调节细胞中基因组的正常功能[28]。Berletch等[29]采用EGCG处理乳腺癌细胞(MCF-7细胞),导致hTERT启动子甲基化和组蛋白H3 Lys9乙酰化的时间依赖性降低,hTERT抑制因子E2F-1在启动子上的结合增加,这表明EGCG具有表观遗传调节的作用。在表观遗传修饰中,DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰[30]。在细胞系研究中,包括EGCG在内的绿茶生物活性物在食管、口腔、皮肤、肺、乳房和前列腺癌细胞的研究中被发现改变了甲基转移酶(DNMT)的活性[31-33]。Fang等[34]认为EGCG可以抑制DNMT的活性并重新激活肿瘤细胞中甲基沉默基因。EGCG在人类结肠癌、食管癌和前列腺癌细胞中也证实了一些甲基沉默基因的重新激活。在口腔鳞状细胞癌细胞系中,EGCG也能增加抑癌基因(RECK)的表达。Zhang等[35]也认为EGCG通过对基质金属蛋白酶抑制剂的去甲基化作用从而在抑制细胞侵袭中发挥关键作用。Bag等[36]发现EGCG以剂量依赖性的方式降低了人表皮癌细胞的DNA甲基化水平。EGCG降低了DNMT 1、DNMT 3a和DNMT 3b的表达,还增加了组蛋白乙酰化。此外,EGCG治疗导致激活沉默肿瘤抑制基因p16INK4α、p21和Cip1。

EGCG抗甲基化的作用机理主要通过抑制甲基转移酶的活性和激活某些甲基沉默基因的活性从而达到去甲基化的效果。

1.5 EGCG理疗放射性损伤的作用机制

放射治疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一,在治疗过程中易破坏正常组织,如放射性肺损伤、食管损伤、皮肤损伤及造血、免疫功能异常等[37]。近年来大量的动物模型实验证实,EGCG具有防治放射损伤的作用。You等[38]使用Co辐照器和22戈瑞剂量建立大鼠肺纤维化模型。连续30 d向腹腔注射EGCG(25 mg/kg)或地塞米松(DEX,5 mg/kg),发现EGCG实验组能够减少死亡率和肺指数评分,改善肺组织学变化,减少胶原蛋白沉积,降低丙二醛(MDA)含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,抑制(myo)纤维母细胞增生,保护和监管血清水平的TGF-β1、iL-6、iL-10、TNF-α,表明EGCG对于辐照诱导的肺纤维化有显著的治疗效果。Zhu等[39]通过对SD大鼠建立放射性肺损伤的治疗模型,EGCG治疗明显降低肺组织肺功能和HYP含量,明显改善充血水肿,EGCG可能通过强化Nrf2-ARE信号通路和阻断氧活性,减轻辐射所致大鼠肺炎和肺纤维化,减轻肺组织损伤。在临床表现中,患者接受乳房切除术后辅助放射治疗,放射治疗结束后1周内大多数患者出现放射性皮炎症状,使用EGCG治疗能减轻八成以上的患者疼痛感,灼烧感和瘙痒感[40]。Zhao等[41]开展的Ⅱ期临床试验,共组织了37例Ⅲ期肺癌接受放疗的患者,诊断为L级放射性食管炎时给予口服EGCG溶液(440 μmol/L,3次/d),结果放疗计划完成后,有8成以上患者放射性食管炎分级降为0级,其他患者也没有出现恶化。急性放射性食管炎(ARIE)是胸腔放疗并发的主要毒性疾病之一,现对 37例IIIA期和IIIB期肺癌患者出现ARIE病症时,给予口服EGCG治疗。每周记录急性放射反应评价标准评分(RTOG)、放疗后第1、2周RTOG评分明显下降,每周疼痛评分也明显低于基线[42]。

EGCG治疗放射性损伤的作用机理可能是EGCG降低丙二醛(MDA)含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,抑制癌细胞增生;或通过强化Nrf2-ARE信号通路和阻断氧活性,减轻辐射所致损伤。EGCG为代表的茶多酚类物质可通过外用、注射、口服等多种治疗方式对防治放射性治疗损伤起到显著功效,可作为安全有效的恶性肿瘤治疗的辅助药物,EGCG在防治放射性治疗损伤临床应用前景广阔。

2 EGCG纳米载体技术研究

EGCG的体外抗癌活性已被证实,但EGCG在现代治疗中的应用有限[43],动物模型表明,EGCG需要一个较高的浓度才能有效的发挥抗癌功效[44]。EGCG化学性质十分活跃,在生理环境中EGCG的稳定性较差,被吸收利用之前易被降解从而不能发挥关键性作用[45]。为了提高以EGCG为代表的茶多酚物质生物利用率,纳米载体技术成为人们关注的重点[46]。纳米技术就是将药物包埋于纳米粒子内部或吸附于纳米粒子表面,达到延缓释放、提高生物活性的目的[47]。EGCG纳米颗粒对于人体黑色素瘤细胞的抑制作用比游离的EGCG效果好8倍[48]。不同的纳米载体的材料对于EGCG生物利用率的作用有所差别,纳米载体成为国内外专家学者研究的重点,主要的材料类型有脂质体、壳聚糖、蛋白质和金属等。不同材料通过不同方式与EGCG结合,脂质体通常利用多层脂质结构对 EGCG 进行包埋;聚合糖与蛋白质则将EGCG 包埋在高分子结构内部或利用其高分子的结构与EGCG的相互作用使其稳定的吸附在表层;金属纳米则是通过吸附作用将EGCG固定在表层[49]。

2.1 脂质体纳米载体

脂质体作为一种纳米载体材料,具有双亲性结构,能同时包埋亲水性和亲油性药物,具有靶向性、缓释性、给药途径多样化等优点,但是贮存稳定性欠佳,其水解产物对人体存在一定毒性。Gülseren 等[50]以大豆磷脂和牛奶磷脂为载体,对EGCG进行包埋,探究两种对载体的稳定性。结构表明,两种纳米载体不仅有利于多酚的释放,还能表现出较高的生物能效。Liao等[51]也研究了以大豆磷脂、吐温、乙醇和糖酯制成的复合脂质体,发现这种复合脂质体纳米材料能改善透皮性,并且表现出较高的靶向精准性。

2.2 壳聚糖纳米载体

目前,已有大量研究表明壳聚糖因其具有良好的生物相容性、微生物降解性强、毒性小的特点,作为EGCG纳米载体具有可行性。Zou等[52]发现明胶-壳聚糖作为纳米载体,可提高EGCG在空气中的稳定性,延缓其在口腔中的释放速度,提高利用率。张茵等[53]通过静电作用将明胶与壳聚糖结合形成可溶性复合物,制作茶多酚-明胶-壳聚糖(TP-Gel-Cs)纳米粒,其载药量为26.82%,包封率高达90.42%,能减缓EGCG在胃肠道中的降解速度。Liang等[54]将EGCG包埋在叶酸改性羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐复合材料中,证明该材料能增强EGCG的缓释性能,在pH为7.4的PBS缓冲液中,缓释时间可长达48 h。

2.3 蛋白质纳米载体

蛋白质的内部具有多种特殊基团,根据温度情况可调整空间结构,并能与EGCG以多种形式结合,体现出较好的包埋活性。常见的包埋材料有乳球蛋白、酪蛋白、白蛋白等。以蛋白质为纳米载体材料具有生物相容性、可降解性、低毒性、价格低廉等特点。有研究[55-57]发现纳米粒的粒径小,体系的点位非常稳定,包埋率高,能有效控制EGCG的释放率,提高茶多酚的生物活性。

2.4 金属纳米载体

金属纳米材料自身具有一定生物活性,表面可以引入多种基团,对其进行功能化修饰后对EGCG进行吸附。随着粒径的减小,纳米粒子的表面原子与总原子数的比值迅速增大,体现出较强的体积效应、表面效应、量子尺寸效应以及宏观量子隧道效应。Hsieh等[58]将绿茶多酚类物质与金纳米材料结合制备载体材料,实验发现在金纳米材料的作用下,多酚类物质的稳定性显著增强,细胞摄取速度明显加快,对癌细胞具有选择毒性,进而实现抗肿瘤的目的。Mukherjee等[59]证实了以岩藻糖-羧甲基壳聚糖与金纳米制成的符合材料能显著提高机体内的抗癌效果。Yuan等[60]发现EGCG与金纳米粒子结合能表现出更好的协同效益。

3 总结与展望

本文针对茶多酚中主要成分EGCG在肿瘤防治中的抗癌机制,包括诱导细胞凋亡、抑制癌细胞转移和侵染、抑制血管生成、抗甲基化和抵御肿瘤治疗中的放射损伤等方面的研究进展进行综述。大量研究表明,茶叶中的茶多酚具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗肥胖、保护心血管和预防糖尿病等多种功效。茶多酚的防癌作用已在多个实验模型系统中得到证实,在肿瘤发展的起始、促进、转移和凋亡等多个环节中茶多酚类物质都能起到抑制肿瘤发生的作用。学者们对于茶多酚作为防癌治癌药物研究进行了大量研究,目前,更应关注以EGCG为主的多酚类物质与其他功能成分,如茶氨酸、咖啡碱等物质拮抗和协同作用,提高EGCG在人体中的利用率。除EGCG外的其他多酚类化合物在生理活性中的研究很少,难以证明其作用机理是否与EGCG相同,需进一步研究其他酚类物质在其辅助抗癌药物的实验效果。茶多酚抗癌的研究中临床效果证据级别不足,同时也缺乏大规模的流行病学的调查研究,临床应用的拓展有待更多的临床试验论证和人群干预研究来做支撑。另外有关茶多酚的抗癌研究中,通常主要集中于功效的研究,对于生物的耐受性、吸收率、抗药性这方面的研究较少。

为了提高EGCG在生物体中的稳定性与生物利用率,还对纳米载体技术在EGCG中的应用进行了概述。以脂质体、壳聚糖、蛋白质、金属为载体,通过包埋、吸附作用提高EGCG的稳定性和利用率。对于提高茶多酚的生物活利用率,茶多酚的结构修饰是研究的重点。目前,纳米载体技术还停留在实验室阶段,需更多的临床实验验证纳米材料的可行性,提高茶多酚的稳定性、靶向释放的精准性以及有效控制其释放速度,从而提高其生物利用率,为茶多酚的临床应用、其他类似新药剂型的开发提供依据。