甜菜红素提取、纯化、稳定性及抗氧化活性研究进展

肖默艳,黄燕芬,王东伟,赵 雷,王 凯,胡卓炎

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

甜菜红色素是世界上广泛使用的一种食用天然色素,包括红色的甜菜红素(Betacyanin)和黄色的甜菜黄素(Betaxanthin)两大类,存在于苋科、藜科、紫茉莉科、仙人掌科以及商陆科等多种植物中。其中藜科最为人们熟悉的是红甜菜,苋科叶子花属的叶子花、马齿苋的花瓣,仙人掌科植物中仙人掌果实、火龙果果皮和果肉、商陆科的商陆浆果、鸡冠花等也均含有丰富的甜菜红素[1]。

甜菜红素的名字来源于红甜菜的拉丁语(Betavulgaris),其最早在1938年由Pucher等[2]从红甜菜根中制备出来。1958年之前,甜菜红素一直被认为是花青素或含氮花青素,随后研究表明该色素不同于花青素[3]。

近年来因化学合成食用色素的安全性问题,其使用已逐渐受限,而天然色素则具有安全性高且兼有营养功能的特点,其研发与应用成为关注热点。甜菜红素的基本结构中包含一个葡糖苷化的酚羟基和环胺基团,是良好的电子供体,能够通过直接清除自由基、抑制脂质过氧化反应、络合金属离子、抑制氧化酶和炎症因子的表达以及激活机体抗氧化体系等方面发挥抗氧化作用。基于前人的研究工作,本文对甜菜红素的结构及其提取纯化、稳定性等方面的研究进展进行综述,为甜菜红素的研究与应用提供参考。

1 甜菜红素的主要成分、化学结构和分布情况

甜菜红素(Betalanin)是水溶性含氮色素,从化学结构(图1)上看,它的基本结构是吡啶衍生物甜菜醛氨酸(Betalamic acid)和仲胺的缩合物[4],基本发色基团是1,7-二偶氮庚甲碱。甜菜红素结构中取代基与1,7-二偶氮庚甲碱共振,化合物颜色为红色,在538 nm处有最大吸收[5]。

图1 甜菜红素基本结构

甜菜红素(Betacyanin)是在甜菜配基(Betanidin)上连接不同取代基的混合物,主要取代情况如表1所示。能与甜菜配基形成糖苷的糖仅有葡萄糖和葡萄醛酸,且附着在C6的效率要低于C5,C5葡萄糖基化后的物质即为甜菜苷(Betanin),糖基化产物的最大吸收波长均向紫光转移[6]。甜菜苷糖基上也能有丙二酸或3-羟基-3-甲基戊二酸取代成酰化物,酰化后使其最大吸收波长红移[7]。此外,甜菜苷分子中C15为不对称碳原子,存在差向异构体,异构体两两之间易发生相互转换[8]。

表1 甜菜红素的主要取代模式、命名及分布

不同种类植物中甜菜红素的组成和含量有所差异。在藜科植物红甜菜中甜菜苷(Betanin)及其异构体异甜菜苷(Isobetanin)占甜菜红素的75%～95%,其余色素所占比例较少[9]。仙人掌科植物的花朵和果实中仅含有27%～30%的甜菜苷,而叶蜡素(Phyllocactin)和异基素(Isophyllocactin)是其特征色素,占甜菜红素总量的45%～55%[10],其余尚含有15%～20%的hylocerenin和isohylocerenin[11]。苋属植物中主要含有苋菜红苷(Amaranthin)及其异构体异苋菜红苷(Isoamaranthin),其中苋菜红苷占80%左右,异苋菜红苷占20%左右,而基本不含其它甜菜红素类色素[12]。千日红素(Gomphrenin)与甜菜苷的区别在于R3和R4上取代模式相反,且千日红素主要存在于千日红花朵中[13]。

2 甜菜红素提取技术

2.1 溶剂提取法

溶剂提取法是利用原料中组分在不同溶剂中溶解度差异,实现提取分离的方法。甜菜红素具有亲水性,易溶于水和与水互溶的有机溶剂中[1]。余莉莉[14]用35%乙醇浸提火龙果果皮色素,最佳提取条件是调整溶液pH至4.0,料液比1∶8 (W/V),提取温度为30 ℃。袁亚芳等[15]用30%乙醇浸提火龙果果皮粉中的甜菜红素,最佳提取条件为调整溶液pH至6.5,30 ℃下提取75 min,提取率仅为4.56 mg/100 g。此外,还有其他学者提取了红甜菜、盐地碱蓬和鸡冠花等中的甜菜红素,因原料不同,最佳提取工艺及提取效果也不同。总之,溶剂提取法所用溶剂价格较低、提取温度较温和、操作简单。但此法提取甜菜红色素耗时较长,所得产品杂质较多、提取率较低、纯度不高。

2.2 超声波辅助提取法

超声波可与媒质产生热作用、机械作用和空穴作用,在一定程度上破坏细胞壁结构,使细胞内物质快速溢出[16]。已有诸多学者利用超声波提取甜菜红素(见表2),此外,还有部分学者对比研究了超声波辅助提取和传统溶剂提取法的提取效果,周俊良等[17]发现超声波辅助提取甜菜红素的提取率较溶剂提取法高0.42%;蓝培基等[18]发现提取条件相同时,超声波提取所得色素提取率是溶剂提取的1.4～2.5倍,而色素产率基本一致时,利用超声波能将提取时间缩短一半。总之,相比于传统溶剂浸提法,超声波辅助提取能够破坏细胞壁结构,促进色素溶出,缩短提取时间、有效提高提取率。

表2 超声波辅助提取甜菜红素

2.3 微波辅助提取法

在微波作用下,不同物质吸收微波的能力存在差异,使得被萃取物质与基体或体系分离,进入到微波吸收能力较差的萃取剂中[22]。运用微波技术提取甜菜红素的主要研究如表3所示,此外,李昌辉等[23]对比了微波辅助提取和传统溶剂提取法,采用微波法提取火龙果果皮色素提取时间由传统溶剂浸提法的120 min减少到3.3 min,微波提取几乎相当于50 ℃水浴120 min的效果。相比传统溶剂提取法,微波辅助提取时间大幅度缩短,所得色素色泽鲜艳,稳定性有所提高,且能减少溶剂消耗,提高色素提取率。

表3 微波辅助提取甜菜红素

2.4 其他提取方法

诸多植物中含有甜菜红素,提取方法研究十分广泛,如超临界CO2萃取、酶辅助提取、γ射线(Gamma irradiation)、高压脉冲电场(Pulsed electric field),还有膜处理技术、超滤、反渗透、低直流电场和低温冷冻等提取方法。

在超临界状态下,CO2超临界流体有选择性地把极性、沸点、分子质量有差异的成分依次萃取出来,实现特定物质的分离提取。Fathordoobady[28]用超临界CO2萃取技术提取火龙果色素,提取效果与最优溶剂法提取效果相当。齐明等[29]在用超临界CO2萃取火龙果果皮粉色素时添加了极性夹带剂,有助于色素脱离基物的束缚,而Luo等[30]优化了超临界CO2萃取火龙果果肉色素的条件,最佳萃取条件为30 MPa压力、40 ℃温度、通入CO2气体流量为30 L/h,萃取60 min。

酶法、γ射线和高压脉冲电场提取的主要原理是破坏植物细胞壁,促进胞内成分流出,提高待提取生物活性成分的提取率。Mohana等[31]研究了酶浓度对火龙果渣粘度及甜菜红素的影响。Nayak等[32]发现γ射线剂量在2.5～10 kGy范围内,随剂量增加甜菜红素提取率逐渐增加,但γ射线剂量超过10 kGy,甜菜红素的结构会发生改变。Chalermchat等[33]利用高压脉冲电场辅助提取红甜菜根中甜菜红素,高压脉冲电场在1 kV/cm时,就可大大提高甜菜红素的渗出率。López等[34]发现脉冲数为5、电压7 kV/cm时,只需35 min可提取90%的甜菜红素。

以超临界萃取技术、γ射线、高压脉冲电场以及膜处理技术为代表的最新提取技术,由于可以在较低的温度下进行,因此能够很好的保持生物活性,并且促进了细胞裂解,改善了细胞膜的通透性,使得甜菜红色素更容易扩散,从而提高色素的提取率。但这些技术目前都处于在研究之中,并且这些技术对设备要求较高,还未能应用于工业生产。

3 甜菜红素的纯化

3.1 大孔树脂吸附法

天然色素粗提液中含有糖、果胶、脂肪、蛋白质及无机离子等多种杂质,其溶解度、透明度、色价和稳定性较差。目前,大孔树脂吸附法是天然色素分离纯化使用最多的方法,主要依靠和被吸附分子之间的范德华力,通过巨大的比表面进行物理吸附而达到分离提纯目的[35]。

宋珊珊等[36]、陈宇等[37]先后从多种极性差异较大的大孔吸附树脂中筛选出纯化火龙果色素效果最佳的树脂,均认为S-8型纯化效果最佳。但吕思润[38]发现S-8吸附率高而解析率极低,筛选出最适树脂是X-5。不同大孔树脂纯化甜菜红素的主要研究结果见表4。前人的研究工作主要以纯化前后的色价来评判纯化效果,通过大孔树脂吸附分离可提高甜菜红素的纯度,采用柱层析法、离子交换法、膜分离法和双水相萃取法等方法,可获得纯化更高的甜菜红素或甜菜苷单体化合物。

表4 不同大孔树脂纯化甜菜红素的研究比较

3.2 柱层析法

柱层析法也是常用纯化甜菜红素的方法,纯化原理是物质在固定相上的吸附能力不同,柱层析过程即是吸附、解吸、再吸附和再解吸的过程。

袁亚芳等[43]用乙醚除去色素粗提物中的脂质、脂溶性色素、黄酮、简单酚类等,再将色素吸附在ODSC-18固相吸附柱上,利用0.01%的盐酸溶液洗去糖、酸等水溶性物质,用乙酸乙酯洗脱出低含量的多酚和相对低聚合度的单宁,再经0.01%盐酸-甲醇洗脱,将洗脱液在35 ℃下真空浓缩,去除甲醇,浓缩液以0.01%的HCl 溶液稀释定容,得到火龙果果皮色素纯化液。赵珍珍[44]也采用ODSC-18纯化火龙果色素。

而王玉平[45]采用Sephadex LH-20纯化甜菜红色素以得甜菜红素和甜菜黄素。Kujala等[46]用GPC-LH20分离纯化制备出甜菜苷。柱层析法纯化得到的甜菜红素的纯度较高,并可通过柱层析分离甜菜红素混合物、获得甜菜苷等单体化合物。

3.3 其他纯化方法

甜菜红素的纯化方法还有离子交换法、膜分离法和双水相萃取法等。Gandíaherrero等[47]采用阴离子交换层析法纯化甜菜红素,赫崇岩等[48]用超滤-纳滤两次膜分离对色素进行纯化,超滤截留了大部分的蛋白质等大分子,纳滤除去了36%糖分、95%金属离子、全部的无机盐离子等杂质,改善了色素品质。Chethana等[49]首次采用聚乙二醇和硫酸铵双水相萃取甜菜红素,萃取后的色素浓度增加了3.4倍。

Gonçalves等[50]利用凝胶渗透层析、正相柱层析、反向柱层析、反向高效液相色谱、离子交换层析和双水相萃取技术六种方法纯化甜菜苷及异甜菜苷,得出以下结论:离子交换层析法是最有效的方法,但纯化后的物质中还含有大量的盐,显示出最高的电导率,需要脱盐处理;反相高效液相色谱法和反相柱层析法的纯化速度较快,效果良好。

甜菜红素较易提取获得,同时其他组分也容易溶出,得到的提取液是含多酚、单宁、糖类、酸类、黄酮类、果胶等水溶性物质的混合物。可以对其进一步分离纯化,便于研究甜菜红素的稳定性和功能活性等。

3.4 甜菜红素的稳定性

甜菜红素呈紫红或鲜红色,较不稳定,易发生降解和变色。温度、pH、光、氧、金属离子和食品添加剂等均能影响其稳定性。

甜菜红素热稳定性较差,在60 ℃以上颜色逐步由红色变成淡黄色,90 ℃时色素完全被破坏而变成无色。热裂解后产生甜菜醛氨酸和环状多巴-5-O-β葡糖苷,进一步脱羧或脱水产生phyllocactin、hylocerenin以及neobetanin[51],或者甜菜醛氨酸与脯氨酸结合形成indicaxanthin 和 isoindicaxanthin[52]。

甜菜红素在pH范围为4～7时呈紫红色,稳定性较好。当pH低于3时呈紫色,甜菜苷C15发生了异构化或脱氢反应,分别生成异甜菜苷和脱氢甜菜苷;而pH大于10时色泽往黄色转变,甜菜苷脱氢形成含酚盐阴离子的化合物,再转变为甜菜黄素[6]。

光照、氧气或氧化剂可加速色素的降解,其中紫外光照射能使色素溶液变色或褪色,纯氧环境加速色素的分解,过氧化氢和次氯酸等氧化剂会降低色素的稳定性。

Al3+、Cu2+、Zn2+和Fe3+等金属离子会使甜菜红素溶液红色减褪,变成淡蓝色或黄绿色;柠檬酸、酒石酸等食用酸会加速色素降解;还原剂、防腐剂会使色素稳定性不同程度的降低;抗坏血酸对火龙果色素有一定的护色作用,但当其浓度超过0.7%,就会从色素稳定剂转变为促氧化剂[53]。

因此甜菜红素以及由该色素加工的产品在生产、运输、存放和使用过程中应保持酸性、低温、避光和隔氧,同时慎重选择食品添加剂,避免使用铜铁铝制容器盛装。

3.5 甜菜红素的抗氧化活性

甜菜红素的基本结构中包含一个葡糖苷化的酚羟基和环胺基团,经证实是很好的电子供体,可通过不同途径和机制抵制对机体有氧化损伤作用的自由基,从而发挥其抗氧化作用。

表5 甜菜红素直接清除自由基研究进展

甜菜红素清除自由基活性与化学结构之间有密切关系,其清除能力随羟基或亚氨基的数量增加而增强,且邻苯二酚是重要的活性基团[65],含有环胺基团的甜菜苷类似于抗氧化剂二丁基羟基甲苯[66]。但是糖苷配基的糖基化会降低其活性,且5-O-β-葡糖苷比6-O-β-葡糖苷的活性更低[67]。

3.5.2 抑制自由基的产生 体内自由基的来源包括非酶促反应产生与酶促反应产生两种途径[68],甜菜红素能够减弱体内过氧化物水平、抑制过渡金属离子的氧化还原,以及抑制氧化相关酶及因子的表达,从而发挥抗氧化作用。

3.5.2.1 抑制脂质过氧化反应 甜菜红素可与脂质链式氧化产生的脂自由基或脂氧自由基反应,从而终止链式反应,抑制脂质氧化。Kanner等[69]研究发现甜菜苷抑制亚油酸过氧化反应优于儿茶素和α-生育酚。此外,甜菜苷对H2O2激活高铁肌红蛋白催化低密度脂蛋白氧化反应[68]、对叔丁基过氧化氢刺激红细胞膜脂氧化[70]及离体的低密度脂蛋白氧化[71]也具有抑制作用,可能是低密度脂蛋白与甜菜苷发生了结合作用,每毫克低密度脂蛋白可以结合0.52 nmol/L的甜菜苷[72]。

3.5.2.2 络合金属离子 甜菜红素能络合部分金属离子,从而抑制由含未配对电子的金属离子催化氧化产生自由基。Wee-Sim等[73]研究发现火龙果色素提取液能络合亚铁离子,降低游离亚铁离子的浓度,从而降低与很多疾病有关的芬顿反应程度。Butera等[70]利用循环伏安法和差分脉冲伏安法测得西西里刺梨中的甜菜红素能络合铜离子以抑制Cu2+诱导的低密度脂蛋白(LDL)的氧化。毕见州[74]发现半枝莲甜菜红素能络合铜离子,抑制过氧化脂质的形成,保护血管内皮细胞,降低体内MDA含量。

3.5.2.3 抑制氧化酶及炎症因子的表达 甜菜红素能够抑制氧化酶的酶活及相关炎症因子的表达,从而起到抗氧化作用。Vidal等[75]发现天然的甜菜红素是环氧化酶和脂氧化酶的有效灭活剂,能抑制环氧化酶通过催化游离花生四烯酸形成前列腺素、抑制脂氧化酶将花生四烯酸转化为白三烯。分子对接表明甜菜红素与酶的氨基酸发生了相互作用,并与靠近环氧化酶活性位点的Try-385和Ser-530相互作用,与靠近脂氧化酶活性位点的Lys-260相互结合,干扰酶活。Reddy等[76]发现100 μg/mL甜菜苷对COX-2抑制活性高达97%,抑制效果相当于180 μg/mL的阿司匹林。

内皮细胞是抗炎分子的理想靶点,其中粘附分子的表达是一个复杂的多因素氧化还原调节过程。Gentile等[77]发现刺梨中提取纯化微摩尔浓度的甜菜红素和甜菜黄素可以通过其自由基清除活性调节细胞ROS/RNS水平以及两种主要的氧化还原敏感转录因子NF-κB和AP-1的活性,从而抑制细胞粘附分子ICAM-1的表达,保护内皮细胞避免细胞因子诱导氧化还原状态引起改变。Han等[78]发现甜菜苷对百草枯诱导的大鼠肝损伤具有保护作用,保护机制是抑制大鼠的组织学变化、降低血清中天冬氨酸氨基转氨酶和丙氨酸氨基转移酶水平、抑制细胞P450(CYP)3A2的mRNA表达和减少线粒体损伤。Tan等[79]研究发现甜菜苷能降低诱导型一氧化氮合酶和环加氧酶的表达、钝化核因子kappa B和溶酶体蛋白酶的活性,抑制百草枯诱导的氧化应激和炎症反应,从而对百草枯诱导的急性肾损伤具有保护作用。

毕见州[74]研究得半枝莲甜菜红素提取物能够显著降低高脂血症大鼠血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),同时升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),显著性降低血清及肝脏组织中MDA含量、提高SOD和GSH-Px活力,表明甜菜红素提取物具有较强的体内抗氧化效果。杨桂芹等[81]发现马齿苋甜菜红素能够显著降低衰老小鼠脑脂褐质含量和心、肝、肾组织中MDA含量,提高心、肝、肾组织中SOD及GSH-Px活力,并且其抗氧化效果明显优于同剂量维生素E。

4 展望

甜菜红素的提取多采用溶剂提取、超声波和微波辅助提取法,其他新型提取技术应用较少,可进一步研究提高提取率而减少杂质的提取方法。大孔树脂吸附法是常用于纯化甜菜红素的方法,但纯化的研究停留在工艺层面,鲜有学者分析大孔树脂对甜菜红素的吸附行为和机理,同时用凝胶色谱、反向高效液相色谱等方法分离甜菜红素以获得甜菜苷等化合物的研究较少。

虽然已有诸多学者从不同角度研究了甜菜红素的抗氧化活性,但仍缺乏全面系统的探索,下一步的研究工作可从下述几方面开展。其一,评价甜菜红素清除自由基能力,需考虑它与不同类型自由基的反应常数及动力学。其二,甜菜红素抑制低密度脂蛋白氧化时,可深入研究LDL的结构和活性变化。其三,金属离子影响甜菜红素的稳定性,但从反面角度考虑,甜菜红素能络合金属离子,从而抑制铜、铁离子引发的氧化反应。其四,脂氧化酶和环氧化酶等均可催化产生自由基,可对甜菜红素抑制自由基酶活性相关机理进行研究。