西藏林芝地区五种野生食用菌氨基酸主成分分析与综合评价

杨 林,池福敏,冯建英,张小栓,吴志刚,*

(1.西藏农牧学院食品科学院,西藏林芝 860000;2.中国农业大学成人教育学院,北京 100083)

西藏地处青藏高原西南部,海拔高,气压低,空气稀薄,富氧量少,紫外线照射作用强,属于极端气候类型。

西藏独特的自然地理条件为野生食用菌生长和繁衍创造了优质的生态环境,使该地区成为野生真菌资源的巨大基因库[1]。野生食用菌味道鲜美、质地脆嫩、热量低,蛋白质和氨基酸含量丰富,风味物质组成独特且具有潜在的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降胆固醇、增强免疫力等生物功效,因此受到消费者的广泛喜爱[2-5]。

氨基酸是一种在人体新陈代谢活动中起到重要作用的生物活性物质,其组成及含量是评价食用菌营养价值的重要指标,同时作为呈味物质对食用菌的风味发挥着重要作用[6-7]。目前对于野生食用菌中氨基酸营养价值评价的方法有很多种,于文清等[8]采用氨基酸评分、化学评分、必需氨基酸指数和等鲜浓度等评价方法比较分析了五种食用菌子实体中的蛋白质氨基酸、游离氨基酸和呈味核苷酸的组成及含量,发现白蘑的营养和鲜味最好,肉蘑较差。杨旭昆等[9]通过氨基酸比值系法对产自云南本地的7种野生食用菌中的氨基酸进行营养价值评价,发现鸡枞的氨基酸营养价值最高,并提出野生食用菌中的氨基酸含量差异较大,有必要对更多种类、不同产地食用菌的氨基酸组成进行深入研究。马长中等[10]研究得出采自西藏林芝地区的橙黄疣柄牛肝菌是一种高蛋白、高膳食纤维、低脂肪的健康食用菌。西藏林芝地区野生食用菌资源丰富,且味道鲜美可口,营养价值丰富,在当地备受消费者喜爱,具有极大的开发利用潜力。但是目前对于该地区野生食用菌中氨基酸营养价值评价的报道还较少,尚缺乏系统的基础理论研究。

因此,本文采用邻苯二甲醛(OPA)和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)柱前衍生化高效液相色谱法测定了采自林芝巴宜区比日神山的五种野生食用菌的氨基酸组成及含量,采用氨基酸比值系数法、主成分分析及聚类分析等方法评价了五种野生食用菌氨基酸的营养价值,旨在更好地开发利用西藏地区的野生食用菌资源,并为其深加工技术的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

五种野生食用菌 均于2017年9月12日采摘自林芝巴宜区比日神山,由西藏农牧学院何建清教授鉴定,详细信息如表1所示;盐酸(优级纯) 洛阳昊华化学试剂有限公司;17种氨基酸标品(色谱纯) 上海源叶生物科技有限公司;甲醇、乙腈 均为色谱纯,迪马科技有限公司。

表1 五种野生食用菌的基本信息

ML204型万分之一天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;101-2AB型电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司;Ag1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 野生食用菌待测样品的制备 将新鲜采摘的野生食用菌样品采用液氮冷研磨处理,研磨好的样品于-80 ℃保存待用。准确称取200 mg野生食用菌样品于水解管中,随后加入10 mL 6 mol/L的盐酸(含有0.5%巯基乙酸),以氮气吹扫封口,将密封后的水解管置于烘箱中(110±1) ℃水解22 h,水解结束后,取出水解管冷却。从冷却后的水解管中取出水解液转移至50 mL容量瓶中,并用去离子水多次冲洗水解管后合并清洗液,定容,滤膜过滤,取滤液1 mL再次用去离子水定容于10 mL容量瓶中,滤膜过滤并转移样品于进样瓶中,备用。

1.2.2 氨基酸含量的测定 采用OPA-FMOC柱前衍生化高效液相色谱法测定五种野生食用菌中氨基酸的组成及含量。色谱柱为Hypersil ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相A液:准确称取结晶乙酸钠6.5 g完全溶解于1000 mL水中,加入三乙胺200 μL,并用5%的冰乙酸调pH至7.20,再加入四氢呋喃5 mL,滤膜抽滤后备用。流动相B液:准确称取结晶乙酸钠6.5 g与400 mL水完全溶解后采用5%的冰乙酸调节PH为7.20,将此溶液与乙腈(800 mL)和甲醇(800 mL)混合后,滤膜抽滤后备用;柱温:40 ℃;紫外检测器:338 nm,262 nm(Pro,Hypro);梯度洗脱程序如下(表2)。本文根据氨基酸标准品的保留时间对样品中氨基酸定性,并使用外标法计算样品中各氨基酸的含量,每个样品分别测定三次重复。

表2 氨基酸分析梯度洗脱表

1.2.3 野生食用菌营养价值评价 五种野生食用菌营养价值的评价以WHO/FAO提出的标准模式谱为参考,根据杨旭昆等[9]的方法分别计算五种野生食用菌中必需氨基酸占总氨基酸的质量分数、氨基酸比值(Ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系数(Ratio coefficient of amino acid,RCAA)和氨基酸比值系数分(Score of ratio coefficient of amino acid,SRCAA)。

1.2.4 多元数据分析 采用相关性分析、主成分分析(PCA)、聚类分析(HCA)综合评价五种野生食用菌中氨基酸的营养价值[11-12]。首先根据相关系数矩阵中相关系数的大小判断五种野生食用菌中氨基酸组成及含量的相关性。降维处理后对数据进行主成分分析,获得特征值及方差贡献率,抽取特征值大于1的成分作为主成分,以每个主成分所对应的方差贡献率作为权重,构建综合评价模型并分别计算五个野生食用菌样品的综合得分,所得分值越高,样品氨基酸品质越好。聚类分析被用来评判五种野生食用菌的差异性。

1.3 数据处理

采用SPSS 24.0数据分析软件对数据进行显著性分析,氨基酸含量以“平均值±标准差”的形式表示,差异分析采用Duncan多重比较,“p<0.05”视为样品间差异显著。

2 结果与分析

2.1 五种野生食用菌氨基酸组成及含量的比较分析

五种野生食用菌中氨基酸种类及含量的测定结果见表3。由表3可知,五种野生食用菌均含有17种氨基酸,其含量分布为0.016～3.205 mg/g,其中必需氨基酸7种,非必需氨基酸10种,且均以谷氨酸(Glu)含量为最高。五种样品的总氨基酸含量及必需氨基酸含量均存在显著差异(p<0.05),牛肝菌中总氨基酸含量最高,达到17.947 mg/g,白青杆菌中必需氨基酸含量最高,达6.924 mg/g,而杨树菌中总氨基酸含量和必须氨基酸的含量均为最低,分别为3.926和1.334 mg/g。马长中等[10]发现采自林芝地区的两种橙黄疣柄牛肝菌样品中含量最高的氨基酸也是谷氨酸。此外,五种野生食用菌中必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)范围为0.515～0.701,白青杆菌、牛肝菌和松茸的EAA/NEAA值均高于WHO/FAO理想蛋白质标准要求的0.6。五个野生食用菌中必需氨基酸与总氨基酸含量的比值(EAA/TAA)范围为0.340～0.421,仅有白青杆菌的EAA/TAA值(0.412)大于WHO/FAO理想蛋白质标准要求的0.4。显然,白青杆菌可作为理想蛋白的来源。儿童必需氨基酸在儿童生长发育过程中扮演着重要的作用[12]。红青冈菌中儿童必需氨基酸含量显著高于其它四个野生食用菌(p<0.05),其CEAA/TAA值也最高,达到0.064。

表3 五种野生食用菌中氨基酸的组成及含量

2.2 五种野生食用菌营养价值评价

食物中蛋白质的营养价值与其氨基酸组成密切相关,食物蛋白质氨基酸与人体蛋白质氨基酸组成越接近,并为人体消化吸收时,其营养价值越高[13]。氨基酸比值系数法是食品中氨基酸营养评价的常用方法[14]。本文以WHO/FAO所提出的氨基酸模式谱理论为对照对五种野生食用菌营养价值进行评价。图1为五种野生食用菌必需氨基酸占总氨基酸的质量分数与WHO/FAO的氨基酸模式比例的比较图。如图1所示,五种野生食用菌中缬氨酸(Val)和异亮氨酸(Ile)比例均明显高于模式谱。松茸、红青冈菌和白青杆菌的苏氨酸(Thr)比例也均高于模式谱。松茸的亮氨酸(Leu)比例高于模式谱,其余四个样品的亮氨酸(Leu)比例均低于模式谱。

图1 五种野生食用菌必需氨基酸占总氨基酸的质量分数与WHO/FAO的氨基酸模式比例的比较图

表4为五种野生食用菌中必需氨基酸的RAA、RCAA和SRCAA的比较分析表。RAA为一定量食物中某种必需氨基酸的含量与WHO/FAO氨基酸模式谱中必需氨基酸含量的比值。RCAA的意义为与氨基酸模式谱相当量的一份食物中必需氨基酸的比值,RCAA值最小的氨基酸可被视为第一限制性氨基酸。根据RCAA值可进一步计算得到SRCAA值,其值越接近100,说明野生食用菌中蛋白质营养价值越高[9,12-14]。由表4可知,松茸和红青冈菌的RAA值和RCAA值更接近WHO/FAO氨基酸模式谱。五种野生食用菌的第一限制氨基酸均为蛋氨酸+半胱氨酸(Met+Cys)。五种野生食用菌的SRCAA值差异显著(p<0.05),其中最高的为红青冈菌,达到77.267,然后依次是松茸、杨树菌、白青杆菌和牛肝菌。显然,红青冈菌和松茸的营养价值较高,可作为优质的食物蛋白来源。

表4 五种野生食用菌中必需氨基酸的RAA、RCAA和SRCAA的比较分析

2.3 五种野生食用菌中呈味氨基酸的含量分析

野生食用菌的蛋白质含量高、风味化合物组成丰富,烹饪或加工可使食用菌蛋白降解为短肽和氨基酸[15],从而获得更加营养丰富、风味独特、味道鲜美的食用品质。食品中的氨基酸按照不同的呈味特征可分为呈鲜、呈甜、呈苦和无味四大类,呈鲜味氨基酸包括天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu),呈甜味氨基酸包括丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro),呈苦味氨基酸包括异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)[16]。五种野生食用菌样品中呈味氨基酸含量见图2。由图2可知,牛肝菌中呈鲜氨基酸的含量显著高于其它野生食用菌样品(p<0.05)。对于呈甜氨基酸含量而言,白青冈菌的含量显著高于其它四个样品(p<0.05)。而牛肝菌和白青杆菌中呈苦氨基酸的含量均高于其它样品。王逍君等[17]通过对五种云南野生食用菌中主要呈味氨基酸的比较分析得出鸡枞菌的呈甜氨基酸和呈鲜氨基酸含量最高,认为鸡枞是一种香甜可口、清香宜人的野生食用菌。对于本研究的五种野生食用菌样品而言,红青冈菌、牛肝菌和白青杆菌整体的呈味氨基酸含量较高,其食用品质更好。

图2 五种野生食用菌中呈味氨基酸含量分析

2.4 五种野生食用菌中氨基酸的主成分分析与综合评价

2.4.1 相关性分析 表5为五种野生食用菌中氨基酸种类间的相关性分析表,如表5所示,野生食用菌中17种氨基酸间均呈正相关关系,并且大多数氨基酸间的相关系数大于0.7,表明野生食用菌中17种氨基酸间存在较强的相关关系,因此可通过主成分分析进一步研究。

表5 五种野生食用菌中氨基酸种类间的相关性分析

2.4.2 主成分分析及聚类分析 本文通过考察特征值λ大于1并综合考虑累计贡献率确定主成分数[11-12]。如表6所示,本文共提取得到两个主成分,累计贡献率达95.531%,可以反应全部样品信息。如图3所示,第一主成分(PC1)的方差贡献率为87.656%,其代表性氨基酸主要包括丙氨酸(Ala)、组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)等。第二主成分(PC2)的方差贡献率为7.876%,代表性氨基酸为缬氨酸(Val)。缬氨酸(Val)是人体必需的限制性氨基酸,是常见的营养剂和代谢改善剂,具有治疗营养不良症,调节血糖,刺激中枢神经系统等作用[18]。

表6 主成分的初始特征值

图3 主成分的因子载荷图

如图4所示,五种野生食用菌按照其氨基酸组成及含量基本可分为2大类,即牛肝菌、白青杆菌和红青冈菌归为第一类,表明这三种野生食用菌的氨基酸组成及含量最为接近,其氨基酸品质也较高。第二类包含了松茸和杨树菌,其氨基酸品质相对较差。聚类分析可以将关系更接近的样本合并为一类,重在区分类别内和类别间元素组成,以明确分类界限。与主成分分析相比,聚类分析不会区分元素重要性,且不会对原始数据信息进行删减,具有等同的类别间重要性[19]。因此,本研究借助聚类分析对五种野生食用菌氨基酸品质差异进行分析,如图5所示,聚类分析与主成分分析得出了一致的结果,这两种分析方法很好地说明了五种野生食用菌氨基酸组成及含量的差异性。

图4 主成分的因子得分图

图5 聚类分析图

2.4.3 综合评价 主成分分析是通过几个较少的综合指标反映整体数据样本的一种统计方法,基于主成分分析的综合评价模型已被广泛应用于食品品质的分析与评价[19-20]。利用综合评价指标F1、F2替代试验所测17种氨基酸,以每个主成分所对应的方差贡献率建立综合评价模型,即F=0.877F1+0.079F2,结果见表7。通过计算综合得分发现五种野生食用菌中牛肝菌的综合得分最高,然后依次是白青杆菌、红青冈菌、松茸和杨树菌。陈万超等[21]采用主成分分析和聚类分析成功构建出了准确、可靠,同时又可甄别香菇与其它食用菌风味差异程度的特征指纹图谱。Wang等[22]采用主成分分析和味觉活性值分析了褐蘑菇在不同生长阶段菌柄和菌盖中的呈味物质,发现5′-鸟苷酸、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)等是褐蘑菇子实体的特征性呈味物质。冮洁等[23]全面评价了美味牛肝菌深层发酵菌丝体和子实体蛋白质的营养价值,发现其子实体的营养价值高于菌丝体,鉴于该菌野生产量不能满足消费者的需求,因此该作者建议采用液体发酵技术生产美味牛肝菌菌丝体,以此作为原料生产功能食品以满足市场需求。此外,马长中等[10]研究发现产自林芝觉木和百巴两地的橙黄疣柄牛肝菌中氨基酸种类齐全,不仅含有人体所必需的8种氨基酸,而且含有多种非必需氨基酸。

表7 五种野生食用菌的综合得分

3 结论

本文对采自西藏林芝地区的松茸、红青冈菌、牛肝菌、白青杆菌和杨树菌中氨基酸种类和含量进行了主成分分析与综合评价。结果表明,五种野生食用菌中均含有17种氨基酸,谷氨酸和丙氨酸含量尤其丰富。五种野生食用菌的第一限制氨基酸均为蛋氨酸和半胱氨酸。此外,红青冈菌和松茸的氨基酸比值系数分最高,分别达到77.267和72.040,均可作为优质的食物蛋白来源。通过主成分分析建立氨基酸综合评价模型得出牛肝菌中氨基酸综合品质最好,然后依次是白青杆菌、红青冈菌和松茸,杨树菌中氨基酸综合品质较差。本文目前仅研究了采自西藏林芝巴宜区比日神山五种野生食用菌的氨基酸种类及含量,进一步研究将在西藏地区收集更多的野生食用菌样品,测定其氨基酸组成和含量,以建立更为详细的野生食用菌品质评价体系,为西藏地区丰富的食用菌资源开发奠定理论基础。