具有潜在降血糖作用乳酸菌的筛选

刘 顺,谢远红,张红星,金君华

(北京农学院食品科学与工程学院,食品质量与安全北京实验室,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京 102206;)

近年来,糖尿病发病率呈现爆发式增长,成为21世纪全球面临的最严重、最危急的健康问题之一[1]。世界卫生组织的数据显示,中国糖尿病的患病率至2017年已居世界首位,人数约1.1亿,约占中国成年人总数的1/10。依照目前发展趋势,到2040年,我国患者将超过1.5亿[2],快速增长的糖尿病人群将会加大各国医疗系统的压力,据研究报道,2015年,全球糖尿病花费为6730亿美元,预测在2040年将达到8020亿美元[3]。

目前,治疗Ⅱ型糖尿病主要方法是药物治疗,如二甲双胍、格列汀类药物、α-葡萄糖苷酶抑制剂等,其中,二甲双胍和格列汀类药物对人体具有一定的副作用[4],而α-葡萄糖苷酶抑制剂具有较好的降糖作用而且对人体脏器无明显毒副作用[5]。

α-葡萄糖苷酶的作用是参与碳水化合物的分解,抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以降低人体血液中的血糖水平[6]。目前已经上市的α-葡萄糖苷酶抑制剂类降糖药仅有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇三种,且均为外国知识产权的产品,国内具有自主知识产权的该类药物鲜有报道,所以研发出具有自主知识产权的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物具有一定意义。

乳酸菌具有多种益生功能,因其性质温和、作用效果明显且持久稳定的特点成为了国内外的研究热点,其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用已被证实。Zeng等[7]发现7株乳杆菌无细胞分泌上清具有α-糖苷酶的抑制能力,Panwar等[8]证明存在于人肠道中的乳杆菌菌株具有α-葡糖苷酶和β-葡萄糖苷酶抑制活性,并且可以降低体内血糖反应[2]。并且有研究表明,乳酸菌对大鼠的高血糖症状以及人的Ⅱ型糖尿病有一定的改善作用[1,5,9-10]。

为了得到具有良好抑制α-葡萄糖苷酶作用和益生效果的乳酸菌,本实验以被证实具有降血糖作用的商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG[11]为对照,对分离自天然食品的36株乳酸菌进行体外筛选,初步研究其降血糖作用,可为进一步研究开发新型功能性乳酸菌产品提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌 详细信息见表1;植物乳杆菌Zhang-LL(CGMCC 6936) 由北京农学院(功能性乳品实验室)冻藏保存;鼠李糖乳杆菌LGG(ATCC 53103) 由中国农业大学教育部-北京市共建功能乳品重点实验室馈赠;4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、α-葡萄糖苷酶 美国Sigma;MRS培养基 北京路桥技术股份有限公司;无水碳酸钠(分析纯)、牛胆盐(纯度70%) 国药集团化学试剂有限公司;盐酸、氢氧化钠 分析纯,北京化工场;人工胃液、人工小肠液 北京欣华绿源科技有限公司。

表1 不同来源乳酸菌

DL-CJ-2ND I型洁净操作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司;SCILOGEX MX-S型漩涡振荡器海门市其林贝尔公司;BSA224S型精密电子天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司;ELx808型酶标仪 美国基因有限公司;SKP-03B型恒温培养箱 苏州培英实验设备有限公司;Eppendoef centrifuge 5417R型冷冻离心机 北京博宇宝威实验设备公司;MLS-3750型高压灭菌锅 日本SANYO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株活化 将在-80 ℃保菌管中保藏的乳酸菌以2%接种量接种于MRS培养基中37 ℃培养12 h,共活化三代。

1.2.2 样品的制备 菌株活化三代后,调整菌悬液密度为1×109CFU/mL,4 ℃下6000 r/min离心10 min,收集发酵上清液。发酵上清液用0.22 μm水系滤膜过滤得发酵上清液样品。

1.2.3α-葡萄糖苷酶抑制率的测定 参考Pierre等[12]和Zhang等[13]的方法并进行修改,以被证实具有降血糖作用的商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG的α-葡萄糖苷酶抑制率为对照。在96孔板210 μL的反应体系中,加入50 μL PBS溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)和50 μL浓度为2.5 mmol/L的PNPG溶液,37 ℃孵育10 min。然后加入30 μL浓度为0.4 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液37 ℃继续反应30 min,最后加入50 μL的浓度为1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应。反应完成后,于酶标仪405 nm处测定吸光值。用PBS溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)作为α-葡萄糖苷酶溶液和待测样品的空白对照,每组设定3个平行。

式中:A为样品组,含有样品溶液和α-葡萄糖苷酶溶液;B为样品空白组,含有样品溶液不含α-葡萄糖苷酶溶液;C为对照组,不含样品溶液含α-葡萄糖苷酶溶液;D为空白组,不含样品溶液不含α-葡萄糖苷酶溶液。

1.2.4α-淀粉酶抑制率的测定 以LGG的α-淀粉酶抑制率为对照,对具有较好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株进行α-淀粉酶抑制率的测定。参考龙楚媚等[14]方法。用0.25 mL样品溶液与1 mg/mL的α-淀粉酶溶液等体积混合,于37 ℃孵育10 min,然后将反应液加入至37 ℃的0.5 mL的1.5%的可溶性淀粉溶液中,于37 ℃反应5 min,再加入1 mL DNS溶液,在沸水浴中反应5 min后迅速冷却至室温,稀释10倍后静置30 min,并于540 nm处测定吸光值。用PBS溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)作为α-淀粉酶溶液和待测样品的空白对照,每组设定3个平行。

其中:A为样品组,含有样品溶液和α-淀粉酶溶液;B为样品空白组,含有样品溶液不含α-淀粉酶溶液;C为对照组,不含样品溶液含α-淀粉酶溶液;D为空白组,不含样品溶液不含α-淀粉酶溶液。

1.2.5 耐酸实验 配制MRS肉汤,用HCl调节pH分别为2.5和3.0,121 ℃高压灭菌15 min。将具有较好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株活化后以2%接种量分别接入pH为2.5、3.0的MRS肉汤中,37 ℃培养8 h后用平板菌落计数法测定其活菌数,以pH为6.8的MRS肉汤作为对照,每组3个平行,分别测定其存活率。

1.2.6 耐胆盐实验 参考周晓莹[15]的方法并进行修改,将具有较好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株活化后以2%接种量分别接入含0.2%、0.3%、0.4%牛胆盐的MRS肉汤中,37 ℃培养4h后用平板菌落计数法测定其活菌数,以不加胆盐的MRS肉汤作为对照,每组3个平行,分别测定其存活率。

1.2.7 耐人工胃肠液实验 将具有较好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株活化后以2%接种量接入pH=3的人工胃液中,37 ℃培养3 h后用平板菌落计数法测定活菌数,以0 h时活菌数对比计算存活率。将在人工胃液中培养了3 h的菌液以2%接种量接入pH=8的人工肠液中,37 ℃培养8 h后用平板菌落计数法测定活菌数,以3 h时人工胃液中活菌数作为对比。每组三个平行,分别测定其存活率。

胃液中菌株存活率(%)=胃液培养8 h后活菌数/胃液培养0 h时活菌数×100

肠液中菌株存活率(%)=肠液培养8 h时活菌数/胃液培养8 h时活菌数×100

1.3 数据处理

采用SPSS 18.0软件对实验结果进行统计分析,组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)以p<0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌α-葡萄糖苷酶抑制率实验结果

由表2可知,发酵上清液对α-葡萄糖苷酶抑制率最高的4株菌分别为YDA11、OD1、OD2和YDB24,其抑制率分别为28.37%、30.26%、30.26%和33.18%,对照菌株LGG抑制率为31.78%,且这4株菌均与对照菌LGG抑制率无显著性差异(p>0.05),不同菌株发酵上清液的α-葡萄糖苷酶抑制率相差较大,这可能是具有α-葡萄糖苷酶抑制能力的为菌株的胞外产物,而不同菌株产生该类胞外物质的能力不一。选取对α-葡萄糖苷酶抑制率较高的YDA11、OD1、OD2和YDB24做进一步研究。

表2 菌株发酵液对α-葡萄糖苷酶抑制率

2.2 菌株α-淀粉酶抑制率实验结果

α-淀粉酶是一种重要的淀粉水解酶,它能够切断淀粉内部的糖苷键,产生糊精、低聚糖和葡萄糖等[16]。能够促进食物中碳水化合物的水解和消化,促进糖分的摄入,从而提高了血糖和血脂含量水平[17]。人体进食后,α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶协同促进血糖的升高,,进而引发高血糖症状。具有良好α-葡萄糖苷酶抑制率的四株菌YDB24、YDA11、OD2和OD1对α-淀粉酶的抑制率见表3。其中菌株YDA11与对照菌株LGG抑制率无显著性差异(p>0.05)。同时,菌株OD1和OD2对α-淀粉酶的抑制率显著高于LGG(p<0.05),由此可见,菌株OD1和OD2对α-淀粉酶具有较强的抑制作用。

表3 菌株发酵液对α-淀粉酶抑制率

2.3 菌株耐酸实验结果

能够耐受胃部酸性环境是益生菌能够进入肠道发挥作用的一大前提,人体空腹时胃液pH在2.0以下,进食后胃液pH在3.0左右,因此,本实验分别以pH为2.5和3.0的酸性环境对菌株耐酸能力进行测定。由图1可知,菌株YDB24、YDA11、OD2和OD1经过体外耐酸性实验8 h的培养,表现出了不同的耐酸能力。在pH2.5的环境中,菌株YDA11与菌株OD1耐酸能力较差,存活率分别为84.49%与89.04%,且与菌株LGG具有显著性差异(p<0.05);菌株YDB24与菌株OD2耐酸能力较好,存活率分别为96.01%与96.83%;在pH3.0的环境中,全部4株菌的存活率都在100%以上,菌株OD2存活率显著高于LGG(p<0.05)。所以,菌株YDB24、YDA11、OD2和OD1均表现出良好的耐酸能力。

图1 乳酸菌耐酸实验结果

2.4 菌株耐胆盐实验结果

由图2可知,菌株YDB24、YDA11、OD2和OD1在含不同浓度的牛胆盐MRS肉汤中胁迫4 h后,表现出不同的耐受能力。菌株OD2在0.3%牛胆盐培养基中存活率可达到94.81%,与对照菌株LGG无显著性差异(p>0.05);在0.4%的高浓度胆盐环境下,菌株OD2存活率依然能够达到68.48%,植物乳杆菌OD2表现出最强的胆盐耐受能力。

图2 菌株耐胆盐实验结果

2.5 菌株耐人工胃肠液实验结果

人体胃液中的HCl和胃蛋白酶以及肠道中碱性环境和胰蛋白酶是对益生菌发挥作用的一大考验。由图3可知,实验菌株在pH=3.0的人工胃液中胁迫3 h后,菌株YDB24与OD2存活率分别为91.48%和94.22%,与对照菌株LGG无显著性差异(p>0.05),表现出良好的耐受能力;转入人工小肠液中继续胁迫8 h后,菌株YDB24、YDA11和OD1存活率均显著低于LGG(p<0.05),菌株OD2存活率为79.99%与LGG无显著性差异(p>0.05)。

图3 菌株耐人工胃肠液实验结果

3 结论与讨论

益生菌来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂是当下研究降血糖问题的热点,具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制率从侧面也反映了该益生菌的潜在降血糖价值。以上实验结果表明,36株乳酸菌对α-葡萄糖苷酶抑制率能力不一,以菌株YDA11、OD1、OD2、YDB24表现最佳,而在进一步的筛选实验中菌株OD2综合性能与对照菌株LGG最接近,因此,筛选出植物乳杆菌OD2为具有潜在降血糖能力的菌株。

目前国内有关微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究不多。陈佩等[18]研究的干酪乳杆菌CCFM0412对α-葡萄糖苷酶的抑制率为29.61%;张军蒙等[19]发现从传统乳酸菌发酵食品中筛选出来的乳双歧杆菌1号BA01对α-葡萄糖苷酶的抑制率达到37.48%。而在测定α-淀粉酶抑制率的实验中,植物乳杆菌OD2抑制率显著高于对照菌株LGG(p<0.05),说明植物乳杆菌OD2在同类特性菌株中表现良好。

乳酸菌能发挥自身益生功能的前提就是能以有效的活菌数进入肠道并在肠道中正常的生长代谢,所以就要求筛选出的乳酸菌具有一定的耐受能力。刑良英等[20]研究发现乳酸菌WHH734在pH=2.5的环境下存活率可达96.85%;而唐雅茹[21]发现植物乳杆菌KLDS1.0386在pH3.0的酸性环境中培养3 h的存活率为84.62%,本实验中筛选的植物乳杆菌OD2在pH为2.5和3.0的环境中存活率分别能达到96.83%和104.06%,对比表明植物乳杆菌OD2具有良好的耐酸能力。

胃肠道中的环境是对益生菌的一大考验。人体肠道中胆盐浓度一般为0.3%左右,菌株OD2在0.3%胆盐环境中胁迫4 h后存活率与对照菌株LGG无显著性差异(p<0.05),且在0.4%的胆盐中存活率仍能达到68.48%;在耐人工胃肠液实验中,植物乳杆菌OD2在胃液中和肠液中存活率分别为94.22%和79.99%,而云月英等[22]研究发现从自然发酵肉制品中分离的乳酸菌M12H和M13在pH=3的人工胃液中存活率为68.66%和56.72%,陈佩等[18]研究发现干酪乳杆菌CCFM0412在pH=8的人工肠液中可存活8h,存活率达到90.98%。说明植物乳杆菌OD2具有良好的胃肠道耐受能力。

乳酸菌在食品行业以及发酵工业等具有广阔的发展前景,而本实验中植物乳杆菌OD2良好的α-葡萄糖苷酶抑制率和胃肠道环境耐受能力,使其在实际应用中价值更加广泛。