红参红景天混合物提取工艺及其抗疲劳作用

李 晶,朱 娜,郑 飞,赵幻希,王 楠,孙红梅,陆泽林,越 皓,*

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院,吉林长春 130117;2.青岛市中心医院药学部,山东青岛 266042)

人参(PanaxginsengC. A. Mey.)为五加科植物人参的干燥根和根茎,是一种名贵中药。红参为人参经蒸制等加工后的干燥根和根茎,红参气味浓厚、甘而兼温、功偏温补。用于脾肾虚空、真阳衰弱之患[1]。现代药理学研究表明,红参中特有的皂苷类成分Rg3和非皂苷成分等都有很好的抗疲劳作用[2-5]。红景天为景天科植物大花红景天Rhodiolacrenulata(Hook. f. et Thoms.)H. Ohba的干燥根和根茎,具有扶正固本,补气养血,清热润肺的功效,主治气虚体弱、病后畏寒、气短乏力等症[6]。红景天中的主要活性成分红景天苷可通过调节抗氧化系统[7]、能量代谢系统[8]及中枢系统[9]三方面,从而发挥抗疲劳作用[10-13]。红景天和红参均可用于气虚乏力之诸证,补气补血补神的功效与中医上所称的“虚则补之”相契合,且红景天性寒,红参性温,二药合用,寒温并用,使温补之中不致偏燥之性,相得益彰。现代研究显示,二药具有类似的“适应原样”作用[14]。因此课题组推测二药配伍组方会具有更好的抗疲劳功效,然而目前,尚无将上述两种药物组方研究其抗疲劳功效的相关报道。

本研究根据我国中医对疲劳病因、病机的分析和治法治则的理论以及中医标本兼治的思想,并结合现代药理学研究,将红参和红景天进行配伍组方,以期获得具有抗疲劳作用的更有效组方。在前期工作中发现,将红参和红景天按比例混合后,进行乙醇回流提取,所得到的提取物具有较单独提取后合并的提取物更好的抗疲劳活性。为进一步验证其抗疲劳的作用,确定其最佳提取工艺,本研究采用正交试验考察了提取因素对工艺的影响,从中优选出红参红景天混合提取物提取的最佳工艺，并对红参和红景天混合提取物(Red ginseng and Rhodiola crenulata,RR)进行抗疲劳功效观察,以期为开发具有抗疲劳功能的保健食品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红参 购于吉林省抚松县万良人参市场;红景天 由同仁堂提供;人参皂苷Re、红景天苷对照品 上海源叶;香草醛 上海海曲化工有限公司;其余试剂 均为国产分析纯;80只健康昆明小鼠 体重(20±2) g,雄性,合格证号SCXK2013-0005,购于吉林大学白求恩医学院实验动物中心;小鼠血清尿素氮、乳酸及肝糖原检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1200型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱 美国Agilent公司;UV-9200型紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总皂苷的含量测定

1.2.1.1 标准曲线的制备 精密称定人参皂苷 Re 对照品1.1 mg,甲醇溶解,制成每1 mL含1.1 mg对照品的溶液。精密吸取对照品溶液10、20、40、80、120、160、200 μL,分别置于具塞试管中,60 ℃恒温水浴挥干,加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL,使残渣溶解,再加入高氯酸0.8 mL,置60 ℃恒温水浴上充分混匀后加热15 min,取出后流水冷却10 min,加入冰醋酸5 mL,摇匀,以同法制得的不加对照品溶液的试剂作空白,于540 nm波长测定吸光度值[15]。以吸光度(Y)为纵坐标,对照品浓度(X)为横坐标绘制标准曲线为Y=11.96X-0.007(R2=0.9999)。

1.2.1.2 供试品溶液的制备和皂苷含量测定 样品制备:分别取红参和红景天(1∶1)研磨成粗粉,混合加入一定量的乙醇,在适当温度下进行有效成分的回流提取,减压浓缩回收乙醇,浓缩液在10 Pa,-50 ℃的条件下,冷冻干燥48 h,得到样品粉末。精密称取干燥粉末30 mg,甲醇超声处理使溶解,得到3 mg/mL溶液,摇匀,滤过,取续滤液50 μL,即得供试品溶液。取续滤液置磨口带塞试管中,根据回归方程计算样品皂苷含量。

式中:m为根据标准曲线计算的皂苷的质量(mg);V0为供试品溶液的体积(mL);N为供试品溶液稀释倍数;V为供试品溶液总体积(mL);W为所取样品的质量(g)。

1.2.2 红景天苷的含量测定

1.2.2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);柱温30 ℃;以V(甲醇)∶V(水)=85∶15作为流动相;体积流量0. 4 mL/min;进样量5 μL;检测波长275 nm。

1.2.2.2 标准曲线的制备 精密称定红景天苷对照品约2.02 mg,置2 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL含1.01 mg对照品的溶液。精密吸取对照品溶液5、10、20、40、80、160、240、320、400、500 μL,分别置于1 mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,以0.22 μm微孔滤膜滤过;以红景天苷对照品的质量(X)对峰面积(Y)进行线性回归,绘制标准曲线为Y=71442x-2.175(R2=0.999)。

1.2.2.3 供试品溶液的制备和红景天苷含量测定 取1.2.1.2项下干燥粉末约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇10 mL,密塞,称定质量,在超声频率40 Hz,超声功率800 W,温度60 ℃条件下,处理30 min,冷却至室温,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,以0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得[16]。根据回归方程计算样品红景天苷的含量。

式中,x为根据标准曲线计算的红景天苷的质量(mg);V0为供试品溶液的体积(mL);N为供试品溶液稀释倍数;V为供试品溶液总体积(mL);W为所取样品的质量(g)。

1.2.3 工艺条件及参数的优选

1.2.3.1 单因素实验设计 按处方比例称取红参和红景天各20 g,共取4或3份,分别加入料液比为1∶10 g/mL,浓度分别为60%、70%、80%、90%的乙醇溶液提取3次,每次90 min,考察乙醇体积分数对人参总皂苷和红景天苷含量的影响;

分别加入料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL的80%的乙醇,提取3次,每次90 min,考察料液比对人参总皂苷和红景天苷含量的影响;

分别加入料液比为1∶10 g/mL,浓度为80%的乙醇溶液提取3次,分别提取30、60、90、120 min,考察提取时间对人参总皂苷和红景天苷含量的影响;

分别加入料液比为1∶10 g/mL,浓度为80%的乙醇溶液分别提取1、2、3次,每次90 min,考察提取次数对人参总皂苷和红景天苷含量的影响[17-19]。

1.2.3.2 正交试验优选提取工艺 以单因素实验结果为基础,采用乙醇回流提取法,选择乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素,采用L9(34)的正交设计进行试验,以人参总皂苷和红景天苷的含量为考察指标进行综合评价,其权重系数均为50%,综合评分(X)=(人参总皂苷含量/人参总皂苷含量最大值)×100×50%+(红景天苷含量/红景天苷含量最大值)×100×50%,其中含量最大值指按9种提取工艺提取两种药材所得样品中含人参总皂苷或红景天苷的最大值,以综合评分为评价指标,分别取9份处方比例的药材,按因素水平表(表1)设计条件进行回流提取。

表1 正交试验因素水平表

1.2.4 抗疲劳功能评价

1.2.4.1 动物分组与给药 实验室温度(23±2) ℃,12 h昼夜循环,自由饮食摄水,适应性喂养7 d。随机分成空白对照组,RR高、中、低剂量组(3.75、1.25、0.625 g/kg),每组20只。空白对照组小鼠给予同体积的生理盐水,各组小鼠灌胃30 d。

1.2.4.2 负重游泳时间的测定 末次给药30 min后,每组随机选取10只小鼠,将小鼠尾根部负荷5%体重铅皮,置于游泳箱内。水深不少于30 cm,水温(25±1.0) ℃,记录小鼠自游泳开始至死亡的时间,即小鼠负重游泳时间[20-21]。

1.2.4.3 小鼠血清尿素氮、乳酸及肝糖原水平的测定 末次给药30 min后,每组中随机选取10只小鼠,在30 ℃水中不负重游泳90 min,休息60 min后眼球取血约0.5 mL,脱颈处死,迅速取肝脏,血液样品离心后收集血清,参照试剂盒说明书进行血清尿素氮、血乳酸及肝糖原水平检测[22-24]。

1.3 数据处理

采用SPSS 16.0 软件对所有数据进行处理,数据用平均值±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,以p<0.05 作为显著性差异,p<0.01 作为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

乙醇浓度对人参总皂苷和红景天苷含量的影响见图1A。随着乙醇浓度的增加,人参总皂苷的含量逐渐增加,分别为20.01、65.73、67.98和69.21 mg/g,乙醇浓度在70%后,人参总皂苷含量增幅减缓,红景天苷的含量在乙醇浓度为80%时达到最高,即0.01981 mg/g,比乙醇浓度为90%时略高。因此,选择乙醇浓度为80%。

图1 单因素实验结果

料液比对人参总皂苷和红景天苷含量的影响见图1B。人参总皂苷和红景天苷的含量均在料液比为1∶10 g/mL时最高,分别为67.98和0.01981 mg/g,故选择料液比为1∶10 g/mL。

提取时间对人参总皂苷和红景天苷含量的影响见图1C。人参总皂苷和红景天苷的含量均在提取时间为120 min时达到最高,分别为70.69和0.02136 mg/g,故选择提取时间为120 min。

提取次数对人参总皂苷和红景天苷含量的影响见图1D。人参总皂苷(40.14、56.98、67.98 mg/g)和红景天苷(0.001426、0.004196、0.02081 mg/g)的含量随着提取次数的增加而不断增加,综合考虑提取时间和提取效率,没有继续增加提取次数,故选择提取次数为3次。

2.2 正交试验优选提取工艺

每个试验条件平行3次,分别按“1.2.1”和“1.2.2”下方法计算人参总皂苷和红景天苷含量,结果见表2和表3。由表2综合评分直观分析结果可知,4个因素对人参总皂苷和红景天苷含量的影响顺序为A

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

2.3 RR对小鼠游泳力竭时间的影响

由表4可知，连续给药30 d后,各剂量组与空白对照组比较,高(p<0.001)、中(p<0.001)和低(p<0.01)剂量组小鼠的力竭游泳时间均显著延长,结果表明,不同剂量RR均可延长小鼠负重游泳力竭时间,加强小鼠运动耐力。

2.4 RR对小鼠血清尿素氮、乳酸及肝糖原水平的影响

末次给药30 min后,对各组小鼠血清尿素氮、血乳酸及肝糖原水平进行检测(表4),结果显示,与空白对照组比较,高(p<0.001)、中(p<0.05)和低(p<0.05)剂量组小鼠血清尿素氮水平均显著降低。血尿素氮是蛋白质有氧代谢的产物,长时间剧烈运动后,机体不能通过分解糖和脂肪来提供足够的能量时,蛋白质、氨基酸和核苷酸分解代谢就会加强,脱氨基产生氨,因此尿素氮含量上升,机体对运动负荷的适应能力下降[25-26]。研究显示,RR能够降低游泳后小鼠血清尿素氮的含量,调节机体尿素氮含量异常,从而增强机体耐力。

由表4可知,小鼠力竭游泳后,与空白对照组比较,高(p<0.001)和中(p<0.05)剂量组小鼠肝糖原水平均显著升高。肝糖原是机体内重要能源物质储备的形式,能够提供运动所需的能量,可长时间维持运动的血糖水平,从而缓解疲劳[27],实验表明,RR能有效减少运动引起的肝糖原的消耗,增加体内能源物质肝糖原的含量,从而延长糖代谢的时间,延长小鼠负重游泳力竭时间,延缓疲劳的产生。

表4 RR对小鼠负重游泳力竭时间、血清尿素氮、血乳酸及肝糖原水平的影响

RR能明显降低小鼠血清中乳酸含量,其中高剂量组(p<0.001)和中剂量组(p<0.05)乳酸水平与空白对照组比较具有显著性差异。当机体内氧供应相对不足时,糖原代谢增加,血清中乳酸等代谢产物增多,从而引起肌肉收缩效率下降导致体力衰竭[28-30]。因而机体内乳酸含量与疲劳程度呈正相关。测定结果表明,RR能够减少运动后血清中乳酸水平,减轻机体代谢产物的堆积,改善机体能量代谢,有利于机体对抗运动性疲劳。

3 结论

RR最佳提取工艺参数为:乙醇浓度80%,料液比1∶10 g/mL,提取时间120 min,提取次数3次。在此最佳提取工艺条件下,测定了RR中人参总皂苷平均含量为(93.96±4.03) mg/g,红景天苷平均含量为(0.01263±0.00015) mg/g。通过动物实验对RR的抗疲劳活性进行了考察,结果表明RR能够显著延长小鼠力竭游泳时间、增加力竭运动过程中肝糖原的储备、降低血清尿素氮和乳酸水平(p<0.001或p<0.05),通过调节机体的代谢状态,从而提高小鼠的运动能力,起到抗疲劳作用。本研究为开发安全有效的抗疲劳保健食品提供了基础理论支撑。