萝种子生物碱提取工艺优化及其抑菌活性

孔 越,郭 斌,*,韩冠英,崔 錾

(1.锦州医科大学药学院,辽宁锦州 121000;2.锦州医科大学附属第一医院,辽宁锦州 121000)

萝藦(Metaplexisjaponica)为萝藦科萝藦属植物,多年生草质缠绕藤本,种子卵圆形,顶端有白色长绢毛,主要生长在我国东北、华北、华东等地。萝藦中含有甾类、生物碱类、萜类、黄酮类、糖类和蛋白质等多种有效成份[1]。近年来,萝藦由于其生物活性作用而备受关注,其挥发油和脂肪油均具有抗菌、抗氧化、抗炎等作用,具有较高药用价值[2-4]。刘威等[5]将新鲜萝藦小分子提取物应用于荷肝癌H22小鼠体内抗癌实验,确定鲜萝藦小分子提取物有明显抗肝癌H22的作用。杨蕾[6]通过定性实验,确定萝藦藤中有生物碱类化合物。

提取生物碱的常见方法有微波辅助提取法、超临界流体萃取法、超声波辅助法、有机溶剂提取法等[7]。微波辅助提取法虽然提取效率高、溶剂使用量少[8],但是该技术只适用于热稳定的物质[9]。超临界萃取法萃取效率高,但对大分子和极性基团多的物质溶解性差,需加入夹带剂,增加了能耗和污染,费力费时[10]。溶剂法成本低,操作简单,根据生物碱的性质。溶剂法提取用的溶剂通常采用水、酸水-有机溶剂(常用0.5～1.0%的盐酸、乙酸等为溶剂)、醇或碱化有机溶剂4种不同的溶剂[11]。目前已有很多种植物的生物碱提取工艺研究报道[12],但是却未见对萝藦种子生物碱提取工艺的报道。

本文采用酸水提取法,在单因素实验的基础上,通过正交设计优化萝藦种子总生物碱提取工艺,并通过抑菌实验初步研究萝藦种子总生物碱对三种供试菌种的抑菌活性,为开发和利用萝藦种子资源提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

萝藦种子 采自于辽宁省锦州市周边地区,经锦州市药品检验所翟铁红主任药师鉴定为萝藦属萝藦种子;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 锦州医科大学微生物实验室提供;LB培养基 酵母提取物5 g,蛋白胨10 g、NaCl 10 g,加水至1000 mL,固体培养基加20 g琼脂粉;氢氧化钠、石油醚(沸点规格30～80 ℃)、二氯甲烷 天津永晟精细化工有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

HH-4型电热恒温水浴锅 上海腾方仪器有限公司;BP211D型电子分析天平 德国Sartorious公司;PHSJ-4A实验室pH计 上海精密科学仪器有限公司;RE-3000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DHG-9245A型恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;SPX-150B生化培养箱 上海博泰实验设备有限公司;LDZM立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;HR60-II-A2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 萝藦种子生物碱的提取方法 将萝藦种子研磨成粉末,取粉碎后的粉末放入石油醚中浸泡过夜[13],萝藦种子粉末:石油醚为1∶2 g/mL,抽滤,晾干,装于密封袋放置干燥处以备用。

取脱脂后萝藦种子粉末加入锥形瓶中,按一定比例加入浓度为0.1 mol/L的一定pH盐酸水溶液,放入水浴锅中,在一定温度和时间的条件下进行提取,抽滤,收集滤液,将滤液旋转蒸发浓缩,在浓缩液中加入适量的碱性水溶液调节pH至10～11,浓缩液出现浑浊沉淀,将浓缩液干燥即得萝藦种子总生物碱。

1.2.2 萝藦种子总生物碱得率的测定 用重量法[14]计算总生物碱得率。

1.2.3 萝藦种子总生物碱的单因素实验 以萝藦种子总生物碱得率为指标,分别考察盐酸水溶液pH、料液比、提取温度、提取时间4个因素对萝藦种子总生物碱得率的影响,每个因素设定5个水平,进行单因素实验,每组实验均重复三次,取平均值。

1.2.3.1 盐酸水溶液pH对萝藦种子总生物碱得率的影响 准确称取10 g萝藦种子粉末5份,放入5个锥形瓶中,采用1.2.1中提到的方法,在料液比1∶10 g/mL、提取温度60 ℃、提取时间1.0 h的条件下,考察盐酸水溶液pH(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0)对萝藦种子总生物碱得率的影响。

1.2.3.2 料液比对萝藦种子总生物碱得率的影响 准确称取10 g萝藦种子粉末5份,放入5个锥形瓶中,在盐酸水溶液pH为2、提取温度60 ℃、提取时间1.0 h的条件下,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对萝藦种子总生物碱得率的影响。

1.2.3.3 提取温度对萝藦种子总生物碱得率的影响 准确称取10 g萝藦种子粉末5份,放入5个锥形瓶中,在盐酸水溶液pH为2、料液比1∶20 g/mL、提取时间1.0 h的条件下,考察提取温度(50、60、70、80、90 ℃)对萝藦种子总生物碱得率的影响。

1.2.3.4 提取时间对萝藦种子总生物碱得率的影响 准确称取10 g萝藦种子粉末5份,放入5个锥形瓶中,在提取液pH为2、料液比1∶20 g/mL、提取温度80 ℃的条件下,考虑提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)对萝藦种子总生物碱得率的影响。

1.2.4 萝藦种子总生物碱的正交试验 在单因素实验的基础上,选择盐酸水溶液pH、料液比、提取温度和提取时间四个影响因素,每个因素选取三个水平作正交试验,以萝藦种子总生物碱得率为衡量实验结果的指标,对提取工艺进行优化,以确定更好的提取工艺条件。各因素水平表见表1。

表1 正交试验因素与水平表

1.2.5 萝藦种子总生物碱抑菌活性实验

1.2.5.1 萝藦种子总生物碱的提取 取脱脂后的萝藦种子粉末10 g,加入pH为2的盐酸水溶液200 mL,放入水浴锅中,在70 ℃下提取2.0 h,用无菌水将得到的萝藦种子总生物碱稀释成浓度分别是0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的萝藦种子总生物碱溶液。

1.2.5.2 菌悬液的制备 将三种供试菌种在无菌操作台分别接种于无菌平板上,在37 ℃培养箱培养24 h后,用接种环挑取典型菌落转移接种在LB液体培养基中,37 ℃培养24 h,用无菌生理盐水将其稀释成含菌量为1×106～1×107CFU/mL的菌悬液,备用。

1.2.5.3 萝藦种子总生物碱抑菌作用 采用牛津杯法[15]测定萝藦种子总生物碱的抑菌作用。在生物安全柜上将灭菌后的固体培养基倒入无菌培养皿中,每个培养皿中倒入20 mL左右培养基,待冷却凝固后,用移液枪吸取0.1 mL菌悬液加到培养基平板上,然后用无菌L型玻璃棒涂布均匀。用无菌镊子夹取已干燥灭菌的牛津杯(内径为6.00 mm)垂直放在含菌平板上,在每个牛津杯中分别加入200 μL(浓度为0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL)的总生物碱溶液,用无菌生理盐水做对照。最后将培养皿放置37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察实验结果,每组实验重复三次。

1.2.5.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用两倍稀释法[16],将在最优条件下制备的总生物碱用无菌水稀释成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL浓度的稀释液,将稀释液分别移取2 mL至无菌培养皿中,然后分别将20 mL固体培养基倒入其中充分混匀,待其凝固后,在每个培养皿中加入0.1 mL菌悬液,涂布均匀,放入37 ℃培养箱中培养24 h,观察细菌生长情况。以不加稀释液的培养皿为空白对照,以无细菌生长的培养基中最低稀释液浓度为最低抑菌浓度。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.2.1 盐酸水溶液pH对萝藦种子总生物碱得率的影响 由图1可知,总生物碱随着pH的增加(pH1.0～5.0),生物碱得率呈先增高后降低的趋势,在pH为3的条件下,生物碱得率最高;当pH大于3时,生物碱得率随pH的不断增高反而下降。考虑到可能由于萝藦种子中生物碱含有与酸发生反应的成分[17]。因此提取萝藦种子总生物碱时,盐酸水溶液pH为2.0、3.0、4.0作为正交试验的三个水平。

图1 盐酸水溶液pH对生物碱得率的影响

2.2.2 料液比对萝藦种子总生物碱得率的影响 由图2可以看出,萝藦种子总生物碱得率随着料液比的增加呈现先增大后下降的趋势,在料液比1∶20 g/mL时总生物碱得率达到最大值;在料液比高于1∶20 g/mL时,总生物碱得率随着料液比增大而降低。这可能是由于在一定范围内增加料液比有助于增大提取溶剂与浸提物的接触面积,提高提取效率[18],但是用量过大反而不利于萝藦种子总生物碱的溶出,降低提取效率。故选定料液比1∶20 g/mL左右。

图2 料液比对生物碱得率的影响

2.2.3 提取温度对萝藦种子总生物碱得率的影响 由图3可以看出,当温度小于80 ℃时,随着温度的升高萝藦种子总生物碱得率逐渐提高;当温度为80 ℃时,总生物碱得率最高。这是由于温度在80 ℃时能更好的破解细胞壁,使生物碱更容易提取出来,从而使总生物碱得率达到最佳。然而当温度大于80 ℃时,萝藦种子总生物碱得率反而开始下降;这是因为温度过高,会破坏其中活性成分,增加溶质杂出量,为后续操作带来不便[19]。因此,选择提取温度80 ℃左右最为合适。

图3 提取温度对生物碱得率的影响

2.2.4 提取时间对萝藦种子总生物碱得率的影响 由图4可以看出,在0.5～2.0 h的范围内,萝藦种子总生物碱得率随着时间增加而逐渐升高,但是时间超过2.0 h后,总生物碱得率明显下降。这可能是由于提取时间过长,影响一部分生物碱的结构,而且随着时间的增加,提取溶剂的挥发也进一步影响着提取率[20]。当提取时间为2.0 h时,萝藦种子总生物碱得率最高。因此,选择2.0 h左右为提取时间进行响应面试验。

图4 提取时间对生物碱得率的影响

2.3 正交试验结果及数据分析

由表2可知,极差的大小反映了实验因素对考察指标的影响程度,极差越大,实验因素对萝藦种子总生物碱得率的影响就越大。因此,在四个影响萝藦种子总生物碱提取工艺的因素中,对总生物碱得率的影响作用大小是:盐酸水溶液pH>提取温度>提取时间>料液比。萝藦种子总生物碱的最佳提取工艺是A1B2C2D1,即盐酸水溶液pH为2、料液比1∶20 g/mL、提取时间2.0 h、提取温度70 ℃。

表2 正交实验设计及结果

由表3可知,盐酸水溶液pH、提取温度对萝藦种子总生物碱得率有显著影响,提取时间和料液比对萝藦种子总生物碱得率的影响不显著。

表3 正交试验方差分析

2.4 验证试验

为了进一步考察以上优化工艺的可行性,取萝藦种子粗粉三份,每份各10 g,按照优选出的最佳工艺进行提取:盐酸水溶液pH为2.0、料液比1∶20 g/mL、提取时间2.0 h、提取温度70 ℃。按1.2.1的实验方法进行检验,得出总生物碱平均得率为2.91%,该结果高于正交实验其他组合,表明该提取条件稳定可行。

2.5 萝藦种子总生物碱抑菌活性实验结果

2.5.1 萝藦种子总生物碱的抑菌效果 萝藦种子总生物碱对三种供试菌种的抑菌效果见表4。由表4可以看出萝藦种子总生物碱除了对大肠杆菌没有抑菌效果外,对其他两种菌均有不同程度的抑菌效果。其中,萝藦种子总生物碱对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强,其次是枯草芽孢杆菌。不同浓度的提取物对供试菌种的抑菌效果也不同,随着浓度的增高,其抑菌效果也逐渐增强。由此得出,萝藦种子总生物碱具有一定的抑菌活性。

表4 不同浓度的萝藦种子总生物碱抑菌效果

2.5.2 萝藦种子总生物碱最低抑菌浓度(MIC)的测定 如表5所示,萝藦种子总生物碱对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.2 mg/mL,对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.4 mg/mL。萝藦种子总生物碱对金黄色葡萄球菌抑菌效果最大,对枯草芽孢杆菌次之,对大肠杆菌没有抑菌活性,抑菌活性随着生物碱浓度的增大而加强。

表5 萝藦种子总生物碱对供试菌种的最低抑菌浓度(MIC)

3 结论

本实验在单因素实验的基础上,采用正交实验对萝藦种子总生物碱的提取工艺进行优化,确定萝藦种子总生物碱的最佳提取工艺是:盐酸水溶液pH为2、料液比1∶20 g/mL,提取时间2.0 h,提取温度70 ℃,在此工艺下萝藦种子总生物碱得率为2.91%。抑菌实验表明,萝藦种子总生物碱对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑菌效果,MIC分别为0.2、0.4 mg/mL,尤其对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强,对大肠杆菌没有抑菌作用。本实验为开发和利用萝藦种子资源提供一定的理论依据,也有助于进一步研究萝藦种子生物碱的价值。