耐低pH酵母菌的分离及其对酸胁迫环境的适应性

徐 伟,柴丽娜,傅徐阳,马婷婷,付大伟,王 薇

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150076;2.黑龙江省质量监督检测研究院,黑龙江哈尔滨 150028)

果酒的品质与酿造果酒的微生物紧密相关,优良的菌种可以提高果酒的质量,是酿造果酒的关键[1]。果酒发酵的过程中,酵母菌的作用是不可忽略的,其中的酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)是产酒精的主要微生物;非酿酒酵母菌则是产香气的微生物,主要产香气的有葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、季也蒙有孢汉逊酵母(Hanseniasporaguilliermondii)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)等。与酿酒酵母相比,非酿酒酵母具有生产分泌多种酶(酯酶、葡萄糖苷酶、蛋白酶等)的能力,可以与原料中的风味前体化合物相互作用产生芳香活性化合物,所以在发酵产香过程中发挥重要作用[2]。Moreria等[3]对葡萄汁有孢汉逊酵母,季也蒙有孢汉逊酵母和酿酒酵母的纯种发酵及混合发酵进行了研究,其中发现季也蒙有孢汉逊酵母具有最高的生长力,同时2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的产生量也很高,并且受其它菌的影响也很小,而这些物质可赋于果酒特有的果香与花香[4]。一般而言,工业化生产相比于传统化生产的酵母菌多样性明显减少。为更好的体现果酒自身的典型性和风格,且保留特定生态条件下果酒香气特征的物质,增加果酒中酵母菌种的多样性是必不可少的[5-6]。

耐酸酵母菌是指可以在pH≤4的条件下生长或代谢的一类酵母菌,当发酵液的pH控制在3.5～4.5左右时,细菌及其他绝大多数杂菌均受到抑制,而果酒酵母则能正常活动[7]。据报道[8],酸胁迫过程会引起氧化胁迫,抗氧化酶的活性发生了改变,生物体内应对氧化胁迫最重要的两类酶分别是超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase,CAT)。活性氧是需氧生物细胞代谢的正常产物,但环境胁迫易导致活性氧簇(ROS)过量产生,使得细胞发生氧化胁迫。为了消除不利影响,生物体需要依靠过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶共同作用将ROS降解为无害物质[9]。因此,本文在酸环境下分离筛选耐低pH酵母菌，并采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察菌体形态以及细胞结构的变化,对耐低pH酵母菌中抗氧化关键酶CAT和SOD的酶活力进行研究,为酵母菌的耐酸机理提供理论依据,为特色浆果果酒的开发提供新的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红树莓、蓝莓、蓝靛果 帽儿山果园采摘;对照菌1 葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)CICC 32337购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心;对照菌2果酒酵母菌 市售菌粉;酵母浸粉、蛋白胨、琼脂、麦芽浸粉等均为生物试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司;钼酸铵、磷酸二氢钾(钠)、磷酸氢二钾(钠) 天津博迪化工股份有限公司;30%过氧化氢 天津市天力化学试剂有限公司;EDTA、邻苯三酚 天津市光复精细化工研究所。

JEM-2100F型日立透射电子显微镜、SU8010型日立冷场发射扫描电镜 HITACHI公司;pHS-3C型雷磁pH计 广州市深华生物技术有限公司;HWS24型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司;H2050R型离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;LG10-2.4A型高速离心机 北京德世科技有限公司;723N UV5100B型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.2 耐低pH酵母菌的分离筛选及鉴定

1.2.1 耐低pH酵母菌的分离筛选 吸取自然发酵7 d内的红树莓、蓝靛果果汁以及蓝莓果汁各1 mL,进行10-1～10-7梯度稀释,选取浓度10-4、10-5、10-6在麦芽汁培养基中进行三区划线初筛,并在YPD琼脂培养基中划线3次以达到纯化,将所得纯菌株进行划线标号并保存。

将分离筛选到的菌株采用WL培养基进行初步鉴定,挑选菌落差异大的菌株接种到pH2.3、2.6、2.9、3.2、3.5、3.8、4.1、4.4 YPD液体培养基中,依据酒精度、产酯量、CO2生成量等发酵性能,筛选出的酵母菌再进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定[10-11]。

1.2.2 生理生化鉴定 主要从脲酶试验、产酯试验、DBB试验、产类淀粉试验、碳源同化试验、氮源同化试验、糖发酵试验及产酸试验等对菌株进行生理生化鉴定,具体方法参照酵母菌的特征与鉴定手册[12-13]。

将所得序列在GenBank数据库中与已知同源序列进行比较(Blast)。下载相关菌种序列,用MEGA软件进行相似性分析,并通过该软件的邻近法(neighbor joining)构建系统发育树[14]。

1.3 耐低pH酵母菌对酸胁迫环境适应性的研究

1.3.1 耐低pH酵母菌的细胞形态与结构的电镜观察 J-23菌株和对照菌1、L-6菌株和对照菌2分别接种于pH2.3和4.8 YPD液体培养基各100 mL,置于28 ℃恒温培养箱中培养2 d,以5000 r/min离心15 min,取菌泥至2 mL EP管中的0.1 mL处,加入固定液于4 ℃冰箱固定待用,再经过冲洗、脱水、置换、干燥、粘样、镀膜等一系列处理即可得到用于扫描电镜检测样[15]。

透射电镜的检测样经过固定、脱水、浸透、包埋、聚合、修块、超薄切片机切片、醋酸铀-枸橼酸铅双染色、透射电镜观察,拍片[16]。

1.3.2 不同pH对酵母菌的抗氧化酶活力的影响

1.3.2.1 不同pH对酵母菌SOD的酶活力影响 SOD的提取:采用甲苯法提取SOD粗酶液,发酵液在5000 r/min,15 min条件下离心,取菌泥,每克菌泥加入0.924 mL甲苯,35 ℃,水浴45 min;加入3 mL pH7.8磷酸缓冲液(含0.1 mmol/L EDTA)提取5 h,使用高速离心机离心,取上清液(即粗酶液)。粗酶液50 ℃预热30 min,离心取上清,加2 mol/L HCl调pH至5.0,4000 r/min离心15 min,取上清液,加入0.6倍的冷丙酮,搅拌,离心,取上清液，再加入0.6倍冷丙酮,离心,留沉淀,即SOD纯产品[17]。

SOD酶活测定:以终止剂改进的邻苯三酚自氧化法,紫外分光光度计420 nm法自氧化速率的测定。9 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH8.2,含1 mmol/L二乙撑三胺五乙酸),25 ℃水浴20 min,再加入40 μL在25 ℃预热的45 mmol/L邻苯三酚溶液(10 mmol/L HCl配制),混匀,每隔半分钟测一次A0,反应3 min,对照组为Tris-HCl,自氧化速率应控制在0.06 A/min;加入一定量的SOD纯产品和9 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH8.2,含1 mmol/L二乙撑三胺五乙酸),再按照相同后续步骤进行操作,每隔30 s测一次As[18-19]。SOD酶活力计算方法:

清除建筑垃圾的活，我们干得惊心动魄。那些新建成的楼房是多层，不是高层，没有电梯，我们沿着楼梯爬行。楼梯都没来得及装护栏，站在顶层往下看，楼梯间的缝隙像刀斧劈出的无底深渊，我看得两股颤颤，双腿松软。还好，楼梯只是我们进到每个楼层的通道，那些垃圾，不用我们运载，我们把它们装入蛇皮袋，扛到西北角一个窗口处。窗外有一只吊篮。我们将垃圾搬到吊篮上。吊篮有专人操作，上上下下，起降匆忙。

式中:V表示反应液体积,mL;V1表示加样体积,mL;N表示样品稀释倍数。

1.3.2.2 不同pH对酵母菌CAT的酶活影响 CAT的提取:吸取1 mL酵母菌液,加入9 mL 0.155 mol/L的KCl溶液于锥形瓶中,充分摇匀,用研钵在冰浴中研5 min,在4 ℃、8000 r/min下将匀浆液离心13 min,吸取上清液,最后用0.85%生理盐水稀释10倍,制得粗酶液。

CAT酶活测定:可见光光度法测定:取6支20 mL试管,如表1的加样量于试管中,记录J-23、L-6菌株及2株对照菌在405 nm处的吸光度,计算CAT酶活力[20]。酶活力计算方法:

表1 测定CAT酶活所需试剂的加样量

式中:A测表示测定管中所加试剂在405 nm处的吸光度;A对表示对照管中所加试剂在405 nm处的吸光度;A标表示标准管中所加试剂在405 nm处的吸光度。

1.4 数据处理

酶活力的测定中每个样品设3个平行,数据处理采用OriginLab Origin 9.0和SPSS Statistics 17.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 耐低pH酵母菌的分离筛选及鉴定结果

2.1.1 耐低pH酵母菌的分离筛选结果 从3种果酒中共得到75株酵母菌菌株,显微镜下观察菌体形态有卵形、圆形、椭圆形等;在YPD琼脂培养基上的菌落形态为奶白色、突起、表面光滑、湿润、无褶皱。通过WL培养基初步鉴定筛选到8株菌落差异明显的菌株,并在8个不同pH下测定发酵性能,筛选出生长状况最好的J-23、L-6菌株为后续实验菌株。

2.1.2 生理生化鉴定结果 J-23和L-6菌株的生理生化结果见表2。

表2 2株菌株生理生化鉴定结果

由表2可知,通过WL培养基初步鉴定菌落特征:J-23菌株中间为淡绿色,边缘带白色;L-6菌株为蓝绿色,边缘带白色。再结合生理生化特征,初步鉴定J-23菌株为季也蒙有孢汉逊酵母菌,L-6菌株为酿酒酵母菌。

2.1.3 分子生物学鉴定结果 通过在BLAST网站中的GenBank核酸序列数据库中对获得的序列进行同源序列搜索和相关信息检索,将分离得到的菌株与模式菌株使用ClustalX 1.83排序后,并使用MEGA three 3.1计算序列相似性。通过Neighbor-Joining分析方法生成系统发育树,并进了1000次bootstrap的统计检验[21],结果如图1、图2。

图1 菌株J-23的系统发育树关系图

图2 菌株L-6的系统发育树关系图

通过构建J-23菌株与10株模式菌株26S rDNA Dl/D2区域序列,发现J-23菌株与模式菌株Hanseniasporaguilliermondii11-494聚为一枝，同源性最近支持率为100%,结合两者D1/D2序列一致性为100%,鉴定J-23菌株为季也蒙有孢汉逊酵母(Hanseniasporaguilliermondii);构建L-6菌株与11株模式菌株26S rDNA Dl/D2区域序列,与模式菌株SaccharomycescerevisiaeYLL20聚为一枝，同源性最近支持率为99%,结合两者D1/D2序列一致性为99%,鉴定L-6菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

2.2 耐低pH酵母菌对酸胁迫环境适应性的研究结果

2.2.1 耐低pH酵母菌细胞形态与结构的变化结果

2.2.1.1 扫描电镜对耐低pH酵母菌细胞形态的观察结果 选择购买的对照菌1、对照菌2与分离出来的J-23、L-6菌株分别在pH2.3和4.8的YPD培养基中培养,在SEM下观察它们的细胞形态变化,结果如图3所示。

图3 不同pH下各菌株扫描电镜图(10k×)

由图3可见,J-23菌株和对照菌1的菌体为椭圆形,L-6菌株和对照菌2的菌体为圆形。

在pH4.8时,J-23菌株相比于对照菌1的细胞表面光滑完整,菌体比较饱满,都有明显的芽痕;在pH2.3时,J-23的菌体外貌大致保持不变,但对照菌1出现明显的凹陷、表面破裂和褶皱,细胞形态出现严重的变形。在pH4.8时,L-6菌株相比于对照菌2的细胞表面光滑完整,菌体都比较饱满,芽痕较多;在pH2.3时,L-6菌株的菌体外貌差异性较小,对照菌2与其相比,菌体出现了明显的褶皱和破皮现象。

2.2.1.2 透射电镜对低pH酵母菌细胞结构的观察结果 选择购买的对照菌1、对照菌2与分离出来的J-23、L-6菌株分别在pH2.3和4.8的YPD培养基中培养,在TEM下观察它们的细胞结构变化,结果如图4所示。

图4 不同pH下各菌株透射电镜图(20k×)

由图4可见,在pH4.8时,J-23、L-6菌株及2株对照菌的细胞核、细胞膜、细胞壁、液泡等细胞结构都比较清晰,其中液泡最大且饱满,可以贮藏和消化细胞内的一些代谢产物,维持细胞的形状,起支持作用;在pH2.3时,J-23菌株的液泡变大,贮藏粒也增多,可以贮藏更多的酶类物质,调节渗透压,协助维持细胞的形状;而对照菌1的细胞壁在酸环境下被破损,导致细胞壁结构不清晰。L-6菌株的细胞结构整体变化不大,而液泡变大,自身可通过调节渗透压来维持完整性;对照菌2的细胞形状出现明显的变形,细胞壁、细胞膜向内凹陷,可能是因为酸环境使某些胞内酶失活,渗透性降低,引起细胞内部脱水。

2.3 不同pH对酵母菌的抗氧化酶活力的影响结果

表3 不同pH下酵母菌中主要抗氧化酶活力的变化结果

2.3.2 不同pH对酵母菌CAT酶活力的影响结果 过氧化氢酶催化H2O2分解为H2O和O2,以清除体内过多的H2O2,从而抵制了氧化胁迫,进而减轻了弱有机酸的产生和酸环境引起的酸胁迫现象。由表3可知,在pH2.3与pH4.8时,J-23和L-6菌株中的CAT酶活力均显著高于对照菌1和对照菌2。在低pH下,耐低pH酵母菌中CAT酶活力的增加,进一步体现了J-23和L-6菌株的耐酸性。

3 结论

本文从自然发酵的蓝靛果与红树莓果汁中,分离筛选出2株耐低pH酵母菌,经鉴定L-6菌株为酿酒酵母菌;J-23菌株为季也蒙有孢汉逊酵母菌。SEM观察pH2.3与pH4.8时,L-6和J-23菌体形态均呈现出:表面光滑完整、饱满,未出现明显的凹陷、褶皱等现象;在TEM下观察结果,细胞结构完整清晰,为维持低pH环境细胞的形状不变,可见胞内液泡增大。同时,L-6和J-23菌株抗氧化酶SOD和CAT酶活力均显著(p<0.05)高于普通对照菌株,表明所分离的2株酵母菌,能够很好地适应酸胁迫的环境,为高酸果汁发酵提供优良菌种。