环状RNA HIPK3、001569联合CEA、CA19-9在结直肠癌中的临床价值

王 宏 李 星 蔚晓勇 郭秀春

随着人们饮食和生活习惯的改变，我国结直肠癌的发病率呈上升趋势。早期结直肠癌症状不典型甚至无症状，患者不易察觉，随着瘤体增大而表现排便习惯、性状的改变、便血、局部腹痛等症状，此时多已进展到中晚期[1]。目前，结直肠癌的主要筛查手段包括直肠指诊、乙状结肠镜或纤维结肠镜检查，但因上述检查均为侵入式，导致人们不愿定期筛查[2]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)被认为与多种恶性肿瘤有关，但对结直肠癌诊断的灵敏度及特异度均较低[3]。环状RNA(circular RNA，circRNA)与癌症的发生、发展及转移密切相关，是近年研究的热点[4]。本研究通过比较结直肠癌患者、结直肠良性疾病患者与健康人群血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA、癌抗原19-9(cancer antigen 19-9，CA19-9)水平，旨在探究联合四者对结直肠癌的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象的纳入

选取本院2016年2月到2018年2月确诊的结直肠癌患者80例作为病例组，患者均为首次住院且经内镜组织学检查确诊。结肠癌的分期依据美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南2013年第3版[5]，其中早期患者27例，中晚期患者53例；腺癌71例，鳞状上皮癌5例，黏液癌4例；高分化癌31例，中分化癌39例，低分化癌10例。同期选取80例结直肠良性疾病(平滑肌瘤15例、纤维瘤19例、脂肪瘤27例及血管瘤19例)患者为良性病变组。选取同期在我院行健康体检的健康人群80例作为对照组。纳入标准：①语言表达能力正常，能与调查人员进行正常的沟通；②研究对象自愿参与本研究。排除标准：①既往有其他肿瘤疾病史者；②排除脑卒中、老年痴呆等神经系统疾病导致的无法采集相关信息和精神分裂症的患者。样本例数计算的统计学依据为：n=2(μα+μβ)2γ2/δ2，其中μα为一类错误概率μ的值，本次研究规定α=0.05，查表得μα；μβ为二类错误概率μ的值，本次研究规定β=0.10，查表得μβ值；γ2为总体方差，通过文献查阅获得；δ为观察组与对照组的患病率之差，通过文献查阅获得。本研究的开展经医院伦理委员会批准，所有纳入对象均签署了项目知情同意书。

1.2 临床资料与样本的采集

由研究人员记录患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史等基本信息。使用促凝采血管收集经禁食10 h以上结直肠癌和结直肠良性疾病患者接受治疗前及健康对照者入院体检时的静脉血5 ml。收集的标本在1 h内于4 ℃条件下以3 500 g离心力(离心半径为10 cm)离心10 min，收集上层血清，并放入-80 ℃冰箱保存备检测。

1.3 血清CEA与CA19-9水平的检测

血清CEA和CA19-9的检测均采用化学发光法，试剂由上海百蕊生物科技有限公司提供。质控品采用英国朗道公司肿瘤高、低值质控品，质控判断标准为Westgard多规则分析。同时计算血清CEA和CA19-9检测的批内、批间变异系数(coefficient of variation，CV)，以评估实验的重复性和精确度。

1.4 circRNA-HIPK3、circRNA-001569表达水平的检测

按照血清RNA提取试剂盒说明书步骤进行血清总RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因组逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-PCR)。RT-PCR按照SYBR GREEN说明书进行，反应体系为：Mix 10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.4 μl。荧光定量PCR循环条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环，每组设置3个复孔。应用PrimerPremier 5.0进行PCR引物设计，使用的circRNA-HIPK3、circRNA-001569与GAPDH引物序列见表1，引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司提供。采用2-ΔΔCt法计算circRNAs的相对表达量，△Ct值=样本Ct值-GAPDH Ct值。同时计算血清circRNA-HIPK3和circRNA-001569检测的批内、批间CV值，以评估实验的重复性和精确度。

表1 circRNA-HIPK3、circRNA-001569与GAPDH的引物序列

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象的基本临床特征与血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA与CA19-9水平

3组在性别组成、年龄、吸烟史、饮酒史等方面均无统计学差异(P>0.05)。单因素方差分析结果显示，3组间血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA与CA19-9水平差异均具有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，与良性病变组和对照组相比，病例组血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA与CA19-9表达水平显著升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA与CA19-9检测的批内CV值分别为3.1%、2.2%、1.3%、0.9%，批间CV值分别为4.0%、2.8%、1.6%、1.0%，均小于5%，提示本实验样本检测具有良好的重复性和精确度。

表2 研究对象的临床基本特征与血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA与CA19-9表达水平

注：a为与病例组比较，P<0.05。

2.2 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平与结直肠癌临床病理特征的关系

血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平与结直肠癌患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史、组织学类型等均无明显关系(P>0.05)，而与结直肠癌的分期和分化程度显著相关(P<0.05)。且circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9在中晚期结直肠癌及低分化结直肠癌患者中的水平增高最为显著，见表3。

2.3 ROC曲线分析

血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9区分结直肠癌与良性病变组和对照组的AUC分别为：0.927(95%CI：0.861～0.990，P<0.001)、0.881(95%CI：0.820～0.951，P<0.001)、0.856(95%CI：0.742～0.903，P<0.001)和0.683(95%CI：0.588～0.790，P<0.001)；在各指标约登指数为最大值时对应的灵敏度及特异度分别为：84.2%/89.0%、91.2%/73.9%、63.1%/79.4%、66.2%/61.7%；对应的临界值分别为：30.3(-log)、8.8(-log)、7.1 ng/ml和28.2 U/ml(图1-A)。当联合circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9时，运用logistics回归模型将上述4个指标(变量)拟合后得到的新的变量-“PRE-1值”，而后将“PRE-1值”带入ROC曲线进行分析，发现联合4种指标在区分结直肠癌与良性病变组和对照组的AUC为0.962(95%CI：0.914～0.999，P<0.001，图1-B)，灵敏度为96.1%，特异度为88.4%。

表3 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平与结直肠癌患者临床病理特征的关系

图1 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9对结直肠癌鉴别诊断的ROC曲线分析

2.4 血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平对结直肠癌发生风险的预测价值

单因素分析结果显示，高circRNA-HIPK3和高circRNA-001569水平是结直肠癌发病的危险因素。多因素分析显示，在校正年龄、性别、吸烟、饮酒等因素影响后，高circRNA-HIPK3和高circRNA-001569水平仍是结直肠癌发病的独立危险因素。见表4。

表4 circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9水平与结直肠癌发生风险的预测价值

注：a为校正年龄、性别、吸烟、饮酒等因素。

3 讨论

虽然近年来关于结直肠癌的临床诊疗技术得到了显著提高，但其患者的5年生存率仍维持在较低水平[6]。目前，结直肠癌筛查手段在临床开展中仍存在诸多不足，例如，指诊及内镜检查的技术含量高，对临床医生的技能要求也较高；其次，该检测的敏感性低，漏诊率较高；更重要的是这些检测具有一定侵入性，使得多数患者不愿意配合检查，阻碍了技术在人群中推广使用。因而，筛选出更多可靠的生物学标志物对结直肠癌的早期干预具有重要意义。

CEA和CA19-9是结直肠癌辅助诊断的重要指标，对结直肠癌的早期诊断有较大价值。韩潞等[7]发现CEA和CA19-9蛋白在结直肠癌组织中呈高表达；杨华等[8]通过对382例结直肠癌患者血清CEA和 CA19-9水平检测发现，CEA和CA19-9阳性率分别为42.9%和18.6%，联合两者检测的阳性率为48.4%。在本次研究中，与良性病变组和对照组相比，血清CEA与CA19-9表达水平在结直肠癌患者中显著升高，且CEA和CA19-9区分结直肠癌患者与良性病变组和对照组的敏感性/特异性为63.1%/79.4%、66.2%/61.7%，与前期报道基本相符[7-8]。但CEA和CA19-9作为结直肠癌诊断的传统指标，尚存在敏感性不足，特异性较低等问题。

近年来的研究表明，circRNA可通过与DNA、RNA或蛋白质结合，在转录或转录后水平，以顺势调控或反式调控的方式，调节基因的表达，参与几乎人类所有的生理及病理性生物学过程[9]。关于circRNA与结直肠癌国内外已有多个研究报道。Hsiao等[10]发现circRNA-CCDC66在结直肠癌细胞中的表达显著上调，且在circRNA-CCDC66被沉默抑制后结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力明显降低，而circRNA-CCDC66因此被认为是一种新的结直肠癌生物标志物。Xu等[11]通过对76例结直肠癌患者癌和癌旁组织中hsa_circ_000984表达水平的检测发现，hsa_circ_000984基因的表达在癌组织中显著上调，进一步的机制研究发现hsa_circ_000984能够通过“海绵作用”抑制miR-106b表达，进而抑制癌细胞的凋亡。上述研究提示，circRNA的差异表达参与了结直肠癌的发生、发展过程。值得注意的是，Long[12]和Liu等[13]利用基因芯片技术与生物信息学分析，分别筛选出了可能调控骨肉瘤和肝癌发生发展的关键circRNA-circRNA-HIPK3与circRNA-001569。circRNA-HIPK3在骨肉瘤患者中显著高表达，且在骨肉瘤细胞株中过表达circRNA-HIPK3后，细胞的增殖活性及克隆形成能力明显增强、凋亡率显著降低[12]；circRNA-001569通过“海绵作用”抑制miR-411-5p和miR-432-5p表达，促进肝癌细胞的增殖与侵袭[13]。而关于circRNA-HIPK3与circRNA-001569在结直肠癌中的表达情况未见报道，其是否具有成为早期肿瘤诊断标志物的潜力是本次研究需要探讨的。本研究通过对80例结直肠癌患者血清学的分析发现，血清circRNA-HIPK3与circRNA-001569在结直肠癌中显著增高，此外，血清circRNA-HIPK3与circRNA-001569水平与结直肠癌分期和分化程度显著相关，两者在中晚期结直肠癌及低分化结直肠癌患者中的水平增高最为显著，提示两者与结直肠癌的不良预后密切相关，该部分结果与前期研究基本相符[12-13]。

ROC曲线分析显示，血清circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9在区分结直肠癌与良性病变组和对照组时具有一定的价值，当联合circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9时在区分结直肠癌与良性病变组和对照组的灵敏度达到96.1%，提示联合上述4种血清标志物具有较高的临床应用价值。多因素分析显示，在校正年龄、性别、吸烟、饮酒等因素影响后，高circRNA-HIPK3和高circRNA-001569水平是结直肠癌发病的独立危险因素。然而，本次研究仍有如下不足：①本研究纳入80例结直肠癌患者，纳入的例数仍然是有限的，后期需要更大样本量的研究来证实circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9在我国结直肠癌患者中的临床价值；②本次研究中采用的circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9多个指标的联合模型虽然较各单独指标有较高的临床价值，但该模型的应用仍有待进一步的验证；③所有研究对象均来源于我院，这可能会造成潜在的选择偏倚，因此本次研究结果有待多中心的前瞻性队列研究进一步验证。

综上所述，本次研究发现联合circRNA-HIPK3、circRNA-001569、CEA和CA19-9对结直肠癌的潜在诊断价值，有望为结直肠癌的临床诊疗提供新的途径。