子宫瘢痕中c-kit和PI3K的表达及与瘢痕愈合关系

赵金萍 王美林 金媛媛

浙江省临海市妇幼保健院(317000)

子宫瘢痕属剖宫产远期并发症[1]。剖宫产术后子宫愈合需要较长时间，研究影响子宫瘢痕愈合相关指标对改善妊娠结局具有重要意义[2]。有研究表明，干细胞因子受体(c-kit)与其配体干细胞因子(SCF)结合后可参与成纤维细胞增殖并在伤口愈合中发挥重要调控作用[3]。磷酸肌醇3激酶(PI3K)可参与造血干细胞及生殖细胞增殖过程，并对细胞周期起重要调控作用[4]。c-kit可通过激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)并活化PI3K/AKT信号通路进而在细胞增殖过程中发挥调控作用[5]。关于c-kit、PI3K表达与子宫瘢痕愈合的相关研究尚未见报道。本研究主要探讨子宫瘢痕中c-kit、PI3K表达及其与子宫瘢痕愈合的关系，为揭示子宫瘢痕愈合的发病机制、提高诊疗效果提供一定依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年10月—2017年7月本院产科剖宫产术后再次妊娠分娩孕妇为研究对象(观察组)。另选取同期本院初次剖宫产孕妇为对照组。纳入标准：①前次剖宫产切口为子宫下段横切口；②晚期妊娠；④对照组孕妇无子宫手术史；⑤孕妇知情且签署同意书。排除标准：①患有急性腹膜炎者；②子宫畸形者；③患有梅毒或严重感染性疾病者；④重度子痫前期或妊娠期肝内胆汁淤积症者；⑤肝、肾等脏器功能异常者。

1.2 检测方法

1.2.1主要试剂及仪器Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司，反转录试剂盒与SYBR Green RCR master mix试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，引物均由上海生物工程股份有限公司合成，c-kit及PI3K抗体、二氨基联苯氨(DAB)与免疫组化(SP)试剂盒均购自北京博奥森生物有限公司。Nano Drop分光光度计购自美国 Thermo Scientific公司，ABI 7900HT实时荧光定量PCR仪与显微镜均购自赛默飞世尔科技公司。

1.2.2标本采集对照组在本次剖宫产术中留取子宫切口部位组织(1.0 cm×0.5 cm)，观察组取前次剖宫产瘢痕部位组织(1.0 cm×0.5 cm)并在术中观察子宫瘢痕愈合情况。将采集标本迅速放入液氮中并置-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.3组织含量检测采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测c-kit、PI3K相对表达量。参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，并参照反转录试剂盒说明书将mRNA反转录为cDNA。按照SYBR Green RCR master mix试剂盒说明书进行PCR扩增。c-kit上游引物序列为5’-GGAAAGAAGACAACGA CACGC-3’，下游引物序列为5’-GGGGTCAGGAATAAACCTCAAGT-3’；PI3K上游引物序列为5’-GGTGACTGTGTGGGACTTATTGA-3’，下游引物序列为5’-CTGATGTAGTGTGTG GCTG TTGA-3’。c-kit与PI3K均以β-actin为内参基因，β-actin的引物序列为：F：5’-TGG CACCCAGCACAATGAA-3’，R：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。qRT-PCR反应体系共为20 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)7.5 μl，cDNA 2.0 μl，上下游引物各0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。反应程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共42个循环，72℃终延伸10 min。反应结束后收集数据并对循环阈值(Ct值)进行分析，采用2-ΔΔCt相对定量法计算c-kit、PI3K mRNA的相对表达量。

1.2.4免疫组化法检测子宫瘢痕组织采用石蜡包埋制作石蜡切片，采用免疫组化SP法检测子宫瘢痕组织中c-kit、PI3K表达量，严格按照SP试剂盒说明书进行操作，DAB显色液显色反应，苏木素复染并在不同梯度乙醇中脱水，中性树脂封片，显微镜下观察。结果判定：从每个切片中随机挑选一个视野，观察c-kit、PI3K表达强度。根据染色程度及阳性细胞率进行评分[7]：①染色程度，无色0分、黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分；②阳性细胞百分比，<10% 0分、10%～30% 1分、31%～50% 2分、>50% 3分。取两组计分之和作为c-kit、PI3K评分。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 基本情况

观察组110例，年龄(30.5±5.1)岁(26～35岁)，孕周(37.5±6.3)周，体质指数(29.0±4.8)kg/m2；本次妊娠与前次剖宫产间隔<3年(14例)、3～<4年(27例)、4～<6年(25例)、6～<8年(27例)、≥8年(17例)；本次剖宫产术中子宫瘢痕愈合[6]良好(87例)，不良(23例)。对照组25例，年龄(29.5±4.9)岁(25～34岁)，孕周(37.3±6.2)周，体质指数(28.2±4.7)kg/m2。两组比较无差异(P>0.05)。

2.2 观察组剖宫产后不同间隔时间瘢痕组织中指标定量表达

观察组剖宫产术后不同时期孕妇子宫瘢痕组织中c-kit、PI3K mRNA表达水平见表1。

表1 剖宫产后不同时间子宫瘢痕组织中指标定量比较

*与对照组比较#与3～<4年比较P<0.05

2.3 观察组剖宫产后不同间隔时间瘢痕组织中指标定性表达

免疫组化结果显示c-kit与PI3K染色呈黄色、棕黄色、棕褐色。c-kit、PI3K表达评分结果见表2。

表2 剖宫产后不同时间子宫瘢痕组织中指标定性比较(分，

*与对照组比较#与3～<4年比较P<0.05

2.4 子宫瘢痕愈合与再次妊娠时间的相关性分析

观察组剖宫产术后3～<4年组子宫瘢痕愈合不良发生率最低(P<0.05)，见表3。

表3 观察组各间隔妊娠时间子宫瘢痕愈合情况[例(%)]

*与3～<4年比较P<0.05

2.5 子宫瘢痕愈合与c-kit、PI3K mRNA表达关系

子宫瘢痕愈合不良组c-kit、PI3K mRNA表达水平高于愈合良好组(P<0.05)，见表4。

表4 瘢痕愈合与c-kit、PI3K mRNA表达

2.6 影响子宫瘢痕愈合的相关因素分析

将影响子宫瘢痕愈合的相关因素进行logistic分析，结果显示再次妊娠间隔时间、c-kit、PI3K表达水平均为影响子宫瘢痕愈合的危险因素，见表5。

表5 影响子宫瘢痕愈合的logistic分析

3 讨论

剖宫产率的升高引起子宫瘢痕妊娠并发症逐年增加，而子宫瘢痕愈合及剖宫产术后再次妊娠时间等成为热议问题[8]。研究显示子宫瘢痕愈合过程涉及肉芽组织增生、炎性反应等一系列生物学过程[9]。剖宫产术后切口处平滑肌细胞生成减少，肉芽组织增生可形成瘢痕而维持组织器官结构完整性，但瘢痕组织可随时间变化而过度增生并导致瘢痕过度纤维化，最终影响瘢痕部位抗张力及其形态结构[10]。因此，本研究拟通过检测剖宫产术后再次妊娠孕妇子宫瘢痕组织中c-kit及PI3K表达，分析其与子宫瘢痕愈合的相关性，为剖宫产术后再次妊娠时间的选取提供指导依据。

相关研究显示，伤口愈合过程中c-kit表达与成纤维细胞增殖有关并可通过调控细胞信号转导途径实现这一过程[11]。c-kit与SCF结合后可促进内皮祖细胞生存及黏附，而内皮祖细胞可促进神经血管再生并可参与神经功能恢复过程[12]。c-kit在多种信号通路中均发挥重要作用，并可调控细胞分化及增殖过程[13]。PI3K可能为瘢痕癌的治疗靶点，并可参与瘢痕癌的发生过程[14]。PI3K/AKT信号通路可促进血管生成及肿瘤细胞增殖等过程[15]。PI3K/AKT信号通路可促使血管内皮生长因子(VEGF)表达水平升高进而参与子宫内膜异位症发生过程[16]。以上研究结果提示，c-kit与PI3K在瘢痕形成及愈合过程中均发挥一定作用。本研究结果显示，与对照组相比，剖宫产术后除3～<4年组外，其他不同时期孕妇子宫瘢痕组织中c-kit、PI3K mRNA表达水平及阳性表达量均升高，其中<3年组与≥8年较高，说明剖宫产术后3～<4年c-kit、PI3K水平降低，促使其胶原纤维与平滑肌相对稳定；而术后>4年 c-kit、PI3K表达量显著增加导致胶原纤维增生并引发瘢痕过度增生。剖宫产术后3～<4年子宫瘢痕愈合不良发生率最低，提示剖宫产术后3～4年可再次妊娠并可降低子宫瘢痕部位破裂的风险。

c-kit与SCF结合后可促进造血干细胞、生殖细胞等活化[17]。PI3K信号通路与VEGF等信号分子相互作用促进血管新生[18]。研究显示，VEGF与瘢痕修复有关，其可通过改变血管通透性并促使血浆蛋白外渗进而促进血管化纤维蛋白基质形成最终形成瘢痕[19]。相关研究表明SCF/c-kit可激活PI3K/AKT信号通路进而参与糖尿病创面修复过程[20]。基于以上研究结果，推测SCF/c-kit可激活PI3K/AKT信号通路进而促使子宫瘢痕愈合。本研究结果显示，子宫瘢痕愈合不良组c-kit、PI3K表达水平显著高于愈合良好组，说明c-kit、PI3K表达与子宫瘢痕愈合过程有关。c-kit、PI3K表达水平均为影响子宫瘢痕愈合的危险因素，提示c-kit、PI3K过表达不利于子宫瘢痕愈合。

综上所述，c-kit、PI3K在子宫瘢痕组织中呈高表达并可促进子宫瘢痕愈合，随着时间延长c-kit、PI3K表达持续增加促使子宫瘢痕过度增生，可能增加子宫破裂发生。关于c-kit、PI3K在子宫瘢痕愈合中的具体作用机制还有待进一步研究。