野生型P53诱导的蛋白磷酸酶1对卵巢癌细胞侵袭的影响

冯艳萍 刘 芳 刘 晶 张红真 李 俊

河北医科大学第一医院(石家庄,050031)

卵巢癌是导致女性癌性死亡的常见恶性肿瘤[1]。野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)是一种依赖于p53的原癌基因，广泛表达于人类乳腺癌、神经母细胞瘤、卵巢透明细胞癌，髓母细胞瘤,结肠癌[2]，鼻咽癌[3]和小细胞肺癌[4]等恶性肿瘤组织中。研究表明，Wip1可能在癌症进展方面起着非常重要的作用,高表达能使野生型P53和P38丝裂原活化蛋白激酶失活，使P16蛋白的表达降低并促进恶性肿瘤进展。另外，在雌激素依赖的器官发生的恶性肿瘤,如乳腺癌中有Wip1基因扩增或过表达，并且Wip1与恶性肿瘤的发生发展相关[5]。但是Wip1参与癌症进展的分子机制仍不清楚。本课题旨在研究Wip1与卵巢癌细胞SKOV3侵袭力的关系，进一步揭示Wip1对SKOV3细胞的迁移和侵袭等恶性生物行为的影响。

1 资料与方法

1.1 实验材料

人卵巢癌细胞株SKOV3购自中国协和医科大学细胞中心，兔抗Wip1购自美国Cell signaling公司，Wip1siRNA、N- siRNA购自美国Sigma公司，Lipofectamine购自美国Invitrogen公司，DMEM-1640培养基购自美国Gibco公司，Trizol试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 转染

将人卵巢癌SKOV3细胞分为Control组(SKOV3细胞组)、N-siRNA组(SKOV3细胞转染阴性质粒组)、Wip1-siRNA组(SKOV3细胞转染质粒组)3组。准备好细胞后，按照Lipofectamin 2000转染试剂盒说明书转染。

1.3 检测SKOV3细胞的侵袭能力

1.3.1划痕实验在6孔板背面，用marker笔比量直尺均匀划横线，每隔0.5～1cm划一道，每道线均横穿过孔，每孔至少穿过5条线。在孔中加入约5×105个细胞，加入培养液，过夜孵育。用枪头比着直尺垂直于6孔板背后的横线划痕，PBS洗涤细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，37℃ 5% CO2培养；取样，拍照。

1.3.2 Transwell小室将Matrigel从-80℃冰箱取出 4℃变为液态后，加入预冷的无血清培养基，混匀，操作在冰上进行。在Transwell小室8μm微孔聚碳酸酯膜上铺入上述混合液，放入24孔板中，37℃培养箱中孵育4～5h待胶体完全凝固。取对数生长期SKOV3细胞，吸出培养瓶中培养液，换入无血清培养基进行饥饿消化，24 h后0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化，PBS洗2～3次，用无血清培养基调整细胞浓度为106/ml。取200μl加入Transwell上室中，同时加入10-9mol/L SP、10-8mol/L SP、10-7mol/L SP、10-7mol/L SP+20μmol/L L-330,060。在24孔板的下室中加入10%胎牛血清+DMEM-1640培养液500μl，将Transwell小室放入24孔板中，培养20～24h。每组设置4个复孔。吸取Transwell上室内液体，冲洗2遍，用棉签轻轻拭去上室上层未侵袭的细胞，PBS洗涤，4%甲醛固定30min，PBS洗涤，晾干。加入0.1%结晶紫染色15min，PBS漂洗3次，室温，30 min晾干。用刀片将小室的膜沿圆边小心切下，镊子夹起，轻放于载玻片上，滴加二甲苯后封片。随机选5个视野，镜下计数穿膜细胞数，取平均数。

1.4 实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

检测沉默Wip1后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达。采用Trizol试剂提取总RNA，经逆转录获取cDNA。取2μl逆转录产物行PCR反应。MMP-2 引物序列：上游引物：5'- ATCCCCCAACCTTTACCA-3'，下游引物：5'- ATCCCCCAACCTTTACCA-3'。MMP-9引物序列：上游引物：5'-GGCGGAGAACAGGGTACGATAAC-3' ，下游引物：5'-CGGGATGCGGCTGGATGGGG-3'。β-actin 引物序列 ：上游引物：5'-GCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTC-3'，下游引物：5'-AGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAG-3'。TIMP-1引物序列 ：上游引物：5’-TGACCAAGATGTATAAAGGG-3’，下游引物：5’-GTTGTGGGACCTGTGGAAGT-3’。TIMP-2引物序列：上游引物：5’- GAGCGAGAAGGAGGTGGATTCCGGG-3’，下游引物：5'- ATGTCAAGAAACTCCTGCTTCGGGGG-3'。反应总体积为20μl，扩增条件为：预变性 95℃ 30 s，进入循环，95℃ 5 s，57～59℃ 30 s，72℃ 30 s扩增40个循环。以β-actin作为内参照校正，应用2△△Ct法分析基因的相对表达，重复3次。

1.5 蛋白质免疫印迹(Western blot)

检测各组细胞中沉默Wip1后SKOV3细胞中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达。①提取总蛋白质：各组细胞中加入1ml细胞裂解液，冰上裂解30 min。移入EP管，4℃、12 000 r/min离心20 min，提取上清液。②采用考马斯亮蓝法测定各样本蛋白含量，将蛋白样品配平后等量分装，-80℃保存。③样品处理、电泳、转印及检测：每个样品取100 μg蛋白，加入6×上样缓冲溶液，置于100℃水中煮5 min，立即插入冰中备用。加样完毕后开始电泳，凝胶电泳以恒定电压的方式进行。浓缩胶中电压设定90 V，进入分离胶后，设定恒压120 V。当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶下端，蛋白质预染Marker充分分离后，终止电泳。电泳完毕，取下凝胶，置入转移的缓冲液中，平衡约20 min。将PVDF膜放置于100%甲醇中浸泡5～10 min激活，蒸馏水清洗2次后放入电转移缓冲液中。将塑料转移盒置于电转移槽内，90 V恒压低温条件下转膜，根据目的蛋白分子量的大小，转膜时间控制在1.5～3 h。④转膜完毕后，取出PVDF膜置于封闭液(5%脱脂奶粉)中，37℃震荡2 h。加入用封闭液稀释的抗Wip1(稀释比例1:2 000)，抗β-actin抗体(稀释比例1:1 000)，4℃过夜。用TTBS洗膜3遍，每次5～10 min，加入用HRP标记的羊抗兔抗体(按1:4000稀释)，37℃孵育2 h。用TTBS洗膜3遍，每次10～15 min，将ECL试剂配好后滴加于膜上，将PVDF膜扫描，传入电脑，运用图像分析软件扫描分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 Wip1-siRNA沉默Wip1基因对SKOV3细胞体外侵袭能力的影响

划痕实验细胞迁移距离Wip1-siRNA组短于Control组 (P<0.01)，N-siRNA组与Control组比较无差异(P>0.05)。Wip1-siRNA转染SKOV3细胞后侵袭基底膜能力受到抑制，SKOV3细胞侵袭到Transwell小室滤膜下细胞数Wip1-siRNA组低于另外两组(P<0.01)，N-siRNA组与Control组比较无差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组SKOV3细胞体外侵袭能力(n=6)

*与control组比较(SNK-q检验)P<0.01

2.2 沉默Wip1后SKOV3细胞中检测因子表达

Wip1-siRNA组MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表达较Control组降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA和TIMP-2 mRNA的表达较Control组无明显改变 (P>0.05)。见表2。

2.3 各组SKOV3细胞中蛋白表达

Wip1-siRNA组MMP-2蛋白和MMP-9蛋白的表达较Control组降低 (P<0.01)，TIMP-1蛋白和TIMP-2蛋白表达较Control组无明显改变(P>0.05)。见表3(图1)。

表2 各组SKOV3细胞中各检测因子表达(n=6)

*与control组比较(SNK-q检验)P<0.01

表3 沉默Wip1后SKOV3细胞中检测蛋白表达(n=6)

*与control组比较(SNK-q检验)P<0.01

图1 沉默Wip1后SKOV3细胞中各蛋白表达

3 讨论

Wip1属于PP2C家族成员，可在各种刺激应激活动中被激活，参与各种细胞活动，在许多恶性肿瘤中高表达并被认为是一种致癌新基因，参与恶性肿瘤的发生、发展。基质金属蛋白酶(MMPs)家族是一类分解多种细胞外基质(ECM)成分的锌蛋白酶，在正常组织中极少表达，当在炎性因子、激素等刺激下细胞与基质发生相互作用时表达量升高，在多种恶性肿瘤中高表达且与肿瘤的侵袭和迁移关系密切[6]。MMP-2和MMP-9是目前研究发现与恶性肿瘤的进展关系最为密切的MMPs成员，MMP-2通过降解细胞外基质穿越基底膜，破坏局部组织结构，促进癌细胞的侵袭，还可以促进肿瘤新生血管的生成。MMP-9主要降解破坏细胞外基质成分中的胶原和明胶[7]。组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是MMPs的天然抑制物，调节细胞生长、迁移、生存和血管生成等，在抑制肿瘤的生长、侵袭和转移中起着重要作用，目前主要有TIMP-1和TIMP-2。TIMP-2主要通过与MMP-2酶原结合阻止酶原的激活，活化MMP-2形成复合物抑制其活性来维持细胞增殖和凋亡的动态平衡。有研究认为MMP-2与肿瘤的恶性程度相关，而MMP-9的含量则与肿瘤的临床分期及远处转移有关[8]。Rasool等[9]研究了基质金属蛋白酶与卵巢癌进展关系，发现卵巢癌患者MMP-2、MMP-9、MMP-11水平均较正常人群升高，因此认为MMP-s在卵巢癌的侵袭中发挥着重要作用，而组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1或TIMP-2则抑制侵袭，具有治疗作用。本研究发现沉默Wip1后，卵巢癌SKOV3细胞的侵袭能力明显减弱，MMP-2和MMP-9的表达水平也相应降低。表明沉默Wip1能够抑制人卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力，可能是通过抑制MMP-2、MMP-9的表达而实现的。

恶性增殖、侵袭和转移等是肿瘤难以治愈、复发的重要因素。Wip1的表达水平与肿瘤的恶性生物学行为密切相关。Wip1是一个癌基因，能够加速癌症的进程。本研究划痕实验显示Wip1-siRNA组细胞横向迁移能力受到抑制，说明Wip1基因沉默后SKOV3细胞横向迁移能力降低，Wip1的表达可以促进SKOV3细胞的横向迁移。Transwell小室测定Wip1-siRNA组SKOV3细胞的侵袭重建基底膜能力受到显著抑制，说明Wip1的表达促进了SKOV3细胞的侵袭。以上均提示沉默Wip1后SKOV3细胞的侵袭和迁移能力降低，这与其他学者的报道相一致。Fu等[10]认为在非小细胞肺癌中沉默Wip1后细胞增殖减弱，细胞凋亡增强。Buss等[11]发现沉默Wip1后能够抑制髓母细胞瘤的增殖和侵袭。Zhang等[12]研究显示，Wip1调节鼻咽癌细胞的增生和侵袭，这与Wip1调控MMP-9的表达和细胞周期的进程及细胞凋亡相关。为了进一步说明Wip1能够加速癌症的进程，Tang等[13]研究认为MMP-s与VEGF是肿瘤细胞侵袭与迁移的关键因子，研究者通过Western blot和免疫组化方法检测到人唾液囊腺癌(ACC)细胞株中有Wip1的表达。沉默Wip1后ACC细胞中MMP-9、VEGF-C的表达下调；反之，若在Wip1沉默的细胞中恢复其表达，则MMP-9、VEGF-C的水平升高，细胞的侵袭和迁移能力也随之增强。因此认为MMP-9、VEGF-C是Wip1的下游靶点。而且研究也证实Wip1的侵袭功能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来调节MMP-9、VEGF-C水平。Wip1在体外调节鼻咽癌细胞的增殖和侵袭可能与Wip1调节MMP-9的表达相关。综上所述，Wip1通过特异性的调控MMP-s促进癌细胞的侵袭和迁移。

但是，也有研究者提出不同的观点。有研究认为沉默Wip1后通过激活AKT/GSK-3β信号通路利于上皮—间质的转化，增强浆液性卵巢癌细胞的侵袭和迁移，而Wip1的高表达则可以逆转这个过程[14]。还有研究发现敲除Wip1基因后可以抑制骨髓间充质细胞的增殖，增强其迁移能力[15]。此外，Wip1还负调节中性粒细胞的迁移(浸润)和炎性介质的释放[16]。

Wip1作为癌基因发挥着促癌作用，Wip1表达水平升高是SKOV3细胞迁移、侵袭能力增加的关键因素之一。Wip1有可能成为卵巢癌的新的治疗靶点。