茭白、葡萄、枇杷茎叶的产甲烷潜力

孙红英，谌茂秋，徐彦胜，朱能敏*

(1.甘肃经纬环境工程技术有限公司，甘肃 兰州 730000； 2.成都新朝阳作物科学有限公司，四川 成都 610000； 3.农业农村部沼气科学研究所，四川 成都 610000)

随着我国城市规模的立体化扩展，大中型城市周边的农业生产逐渐由传统的水稻、小麦等粮食作物种植转变成以水果、蔬菜等为主的非粮作物种植，随之产生的大量作物茎叶的处理、处置已经成为推进乡村振兴过程中亟待解决的环境问题。这些作物茎叶富含有机质，可用作农村户用沼气池发酵的原料以实现其稳定化和资源化。长期以来，众多学者对小麦、水稻和玉米等主粮作物秸秆产甲烷的可行性及其潜能开展了广泛的研究，但对于非粮作物，特别是果蔬茎叶等废弃生物质产甲烷的可行性和潜能还鲜见研究报道[1-2]。鉴于此，本研究以典型非粮作物茭白茎叶、葡萄茎叶和枇杷茎叶作为底物进行厌氧产甲烷试验，分析测定发酵过程中的产气量、甲烷含量，及其木质纤维素含量和红外光谱特征等，以期为废弃生物质的资源化利用和相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用废弃生物质系采自农业种植区收获果实后的茭白、葡萄、枇杷的茎叶。采集的茎叶经过自然晾干、粉碎、过筛等预处理后冷藏备用。厌氧发酵菌种取自以废弃蔬菜叶为底物的厌氧发酵罐。分析纯及更高纯度的化学试剂购自中国国药集团，试验用水由密理博(Millipore)纯水仪(18.2 MΩ·cm-1)提供。

1.2 方法

各试验组分别取1 g相应植物的茎叶、20 mL菌液[菌浓度(2～3)×108mL-1)]、50 μL微量元素溶液(2 mg·kg-1Co、2 mg·kg-1Ni、10 mg·kg-1Fe、10 mg·kg-1Mn和10 mg·kg-1Zn)和40 mL去离子水一并放入100 mL血清瓶中，调整碳氮比后通入高纯氮气将瓶中剩余空气排走。在不添加作物茎叶、不调整碳氮比条件下取与试验组相同的菌液、微量元素溶液和去离子水放入血清瓶中，排空剩余空气作为空白组。密封后的血清瓶放入35 ℃恒温培养箱中进行发酵产甲烷。每组试验设置3个平行，每天定时测定产气量并取样分析，发酵结束后取固相物自然风干备用。

1.3 测定

排水集气法测定产气量，气相色谱-氢火焰离子检测法测定甲烷含量，气相色谱-热导检测法测定有机酸含量。元素分析仪(vario MICRO select)分析元素组成，美国国家可再生能源实验室木质纤维素测定法(NREL)分析木质纤维素含量。

2 结果与分析

2.1 茎叶基本理化指标

表1显示，枇杷和茭白茎叶的总固体含量相近，大于葡萄茎叶；枇杷和葡萄茎叶的挥发性固体含量相近，小于茭白茎叶。三种植物茎叶的总氮含量相近。枇杷茎叶总碳含量最高、葡萄茎叶总碳含量最低。一般来说，适宜厌氧发酵的底物碳氮比为25～30[3]，从表1可以看出，茭白茎叶的碳氮比处于此范围内，而枇杷和葡萄茎叶的碳氮比在此范围之外。

表1 供试植物茎叶的基本理化性质

就厌氧微生物降解难易程度而言，生物质中半纤维素是最易被厌氧微生物代谢的组成部分，纤维素次之，木质素最难被降解[4]。如表2所示，茭白茎叶中半纤维素和纤维素含量最高。就此推测，茭白茎叶在供试材料中的可生物降解性最强。结合木质纤维素组成、碳氮比和挥发性固体含量可以预判，3种茎叶中茭白茎叶的产甲烷潜力最高。

表2 供试植物茎叶半纤维素、纤维素和 木质素构成

2.2 发酵过程中pH及有机酸变化

适宜的pH是厌氧微生物进行正常生理代谢活动的必要条件。pH在6.5～7.5比较有利于厌氧微生物的生长代谢[5]。如图1所示，3种植物茎叶在发酵过程中pH都处于碱性范围(7.0～7.5)，且三者差异不显著，发酵体系没有出现严重酸化现象。

图1 植物茎叶发酵过程中pH值变化

一般来说，发酵体系pH的变化与有机酸的产生、累积和消耗密切相关。由图2～5可知，空白组中总有机酸累积浓度最低(<100 mg·L-1)，且以乙酸累积为主，枇杷和茭白组中以丙酸累积为主，最高浓度介于800～1 200 mg·L-1，所有发酵体系中丁酸的累积浓度都低于10 mg·L-1。这说明供试生物材料在生物质厌氧发酵产酸阶段以产乙酸和丙酸为主。乙酸、丙酸浓度在发酵过程中都是先逐渐升高然后慢慢降低直到小于50 mg·L-1，表明随着发酵的进行有机酸被慢慢降解转化为甲烷。枇杷组中有机酸含量在70 d左右就稳定在20 mg·L-1左右，葡萄组中有机酸含量在110 d后才逐渐稳定，茭白组中有机酸含量在55 d左右就稳定在5 mg·L-1左右。结果说明，茭白叶中的有机碳最易被厌氧微生物降解利用，且降解速率最快。

图2 空白组发酵过程中有机酸含量变化

图3 枇杷组发酵过程中有机酸含量变化

图4 葡萄组发酵过程中有机酸含量变化

图5 茭白组发酵过程中有机酸含量变化

2.3 红外光谱特征变化

傅立叶红外光谱能反映有机物中官能团结构组成。如图6所示，发酵前3种植物茎叶在850～900 cm-1都没有检测到任何的特征峰，但发酵后此波数范围内却出现了一个在空白组中也检测到的单肩尖峰，推测该峰可能是菌种中有机质的特征峰，而非作物茎叶降解后形成的特征峰。发酵前枇杷茎叶和葡萄茎叶分别在1 700～1 750 cm-1、1 250～1 375 cm-1有一单肩弱峰，但这2个单肩峰在发酵后却消失了。已有峰的消失和新峰的出现表明发酵过程中作物茎叶发生了分解，导致某些原有的有机官能团消失和新官能团形成。

图6 厌氧发酵前后供试植物茎叶的红外特征变化

沼气产量能够直接反映厌氧发酵过程和发酵效率。如图7所示，空白组日产气量在第一天达到8 mL，之后日产气量几乎都为0；葡萄茎叶日产沼气量在前20 d较高，之后日产气量降到5 mL以下，且零产气量天数增多；枇杷茎叶日产气量在前70 d波动较大，最高日产气量达到25 mL；茭白茎叶日均产气量在前40 d整体较高，最高达到了40 mL，日产气量超过10 mL的时间也达到了20 d。从日产气量有效持续时间可以判断，供试植物中茭白茎叶产气潜力最高。结合图1中pH的变化，在整个发酵过程中3种植物茎叶发酵体系酸碱度适中，零日产气量的出现可能与底物浓度低、微生物出现了贫营养的饥饿状态有关。

图7 供试植物发酵产沼气动态

累计产气量不仅能表明底物的产气潜力，也能反映发酵过程中底物的降解效率。如图7所示，空白组累计产气量只有10 mL左右，说明在缺乏底物的条件下细菌只能利用自身细胞质作为碳源和氮源进行内源呼吸，产气量有限。供试植物中，茭白茎叶累计产气量最高(400.8 mL)，枇杷茎叶次之(250.8 mL)，葡萄茎叶最低(157.5 mL)，茭白茎叶的累计产气量分别是葡萄茎叶和枇杷茎叶的2.5倍和1.6倍。此外，葡萄茎叶20 d累计产气量接近总产气量的90%，其产气潜力几乎完全释放。枇杷茎叶发酵体系在40 d和70 d分别达到一个产气量峰值，70 d之后累计产气量趋于稳定。茭白茎叶的累计产气量不仅在前40 d快速增加，即使是在40 d之后其累计产气量也依然在缓慢增加。

甲烷是沼气中唯一的可燃组分，其在沼气中的体积分数不仅决定了沼气的品质，而且直接反映了产甲烷菌的代谢活动。当发酵体系严重酸化时，沼气中的二氧化碳体积分数显著上升，而甲烷的体积分数明显下降，且二氧化碳的体积分数高于甲烷[6]。如图8所示，3种供试植物日产甲烷量的分布趋势与日产沼气量相似。茭白茎叶日产甲烷量在前40 d中超过5 mL的时间达到了15 d，最大值为每天20 mL，之后日产甲烷量依然保持在2～3 mL。枇杷茎叶日产甲烷量峰值出现在30～80 d，最高日产量为16.5 mL，但80 d后日产甲烷量下降，且日产量达到1.5 mL的天数不到10 d，其余时段内日产量几乎为0。葡萄茎叶日产甲烷量只在10～20 d超过了5 mL且最大日产量为13 mL，其余时段内的日产量都不到2.5 mL，且零产甲烷天数较多。显然，茭白茎叶的产甲烷潜力较枇杷茎叶和葡萄茎叶大，且产甲烷最快，说明茭白茎叶能较容易地被发酵过程中不同阶段的微生物代谢利用，并最终转化成为能源性气体——甲烷。

图8 供试植物发酵产甲烷动态

供试植物的累计产甲烷量变化趋势与累计产沼气量相似。茭白茎叶累计产甲烷量最高(182.3 mL)，枇杷茎叶次之(91.4 mL)，葡萄茎叶的累计产甲烷量最低(37.5 mL)，葡萄茎叶的累计产甲烷量只有茭白叶的1/5。茭白茎叶在前40 d的产甲烷速率在整个发酵周期内最高，明显高于其他2种植物茎叶的产甲烷速率。在40 d后，茭白茎叶发酵体系的甲烷产量仍在缓慢增加，但枇杷茎叶和葡萄茎叶发酵体系的累计甲烷产量在最高产气速率之后就几乎稳定不变了。这表明，茭白茎叶中最易降解的成分被微生物快速利用后，剩下的有机组分仍能够缓慢地被微生物代谢降解，但枇杷茎叶和葡萄茎叶中的剩余有机组分却难以被微生物进一步利用。就累计产甲烷量达到稳定的时间而言，葡萄茎叶达到稳定的时间是茭白茎叶的1/2，而枇杷茎叶有2个亚稳定时间(分别是40和70 d)。结合累计甲烷产量变化趋势，葡萄茎叶较短的稳定时间表明葡萄茎叶中易降解成分含量低，有效发酵时间短，产气量(沼气和甲烷)低。枇杷茎叶有2段稳定时间，说明枇杷茎叶中易代谢降解成分含量也较低，但难降解成分含量并没有葡萄茎叶高，故而在最易降解的有机组分被利用之后，剩下的有机组分还能够在微生物协同作用下被缓慢代谢利用并出现第2个产气稳定期。

如表3所示，3种植物茎叶的半纤维素含量下降幅度都超过了70%，纤维素含量下降幅度只有茭白茎叶达到了28.34%，木质素含量反而上升。这表明半纤维素对产甲烷的贡献率基本能达到70%以上，而纤维素的贡献率只有茭白茎叶达到了30%左右，木质素对3种植物茎叶的产甲烷贡献率均为0。发酵后3种供试植物中半纤维素含量均大幅下降，而木质素含量不降反升。这说明半纤维素是厌氧微生物最易利用降解的组分，而木质素较难被微生物代谢降解[7]。枇杷茎叶和葡萄茎叶半纤维素含量下降幅度较茭白茎叶小，原因可能是葡萄茎叶和枇杷茎叶中黄酮类和多酚类物质在水解产酸阶段被释放进入液相产物，对厌氧微生物，特别是产甲烷菌的生理代谢产生了一定的抑制作用[7-8]，从而导致葡萄茎叶和枇杷茎叶发酵体系产气量较小。

表3 供试植物茎叶发酵后木质纤维素 相对含量降幅

3 讨论

与乙酸相比，丙酸是较难被产甲烷菌代谢利用的有机酸之一，故而丙酸较乙酸更容易在发酵体系中累积[9]。然而在本研究中，葡萄茎叶发酵体系中却以乙酸累积为主，说明葡萄叶发酵过程中的丙酸产量可能一直较低，葡萄茎叶组成不利于丙酸的产生。不同茎叶体系中，有机酸浓度开始下降以及最终达到平衡稳定的时间并不一致，间接说明了不同植物茎叶发酵速率的差异。结合供试3种植物茎叶的木质纤维素构成可以推测，发酵前期茭白茎叶快速产气主要是微生物代谢利用半纤维素导致的，当半纤维素被降解利用之后，水解产酸菌在协同配合下进一步水解纤维素，生成产甲烷菌可利用的底物。枇杷茎叶和葡萄茎叶的半纤维素含量小于茭白茎叶，这导致前期枇杷茎叶和葡萄茎叶的产甲烷速率都小于茭白茎叶。另外，葡萄茎叶纤维素含量最低但木质素含量却最高，在最易降解的半纤维素被利用完之后，水解产酸菌难以代谢剩下的大量木质素，导致其产气周期最短。枇杷茎叶的半纤维素和纤维素含量都高于葡萄茎叶，但木质素含量却低于葡萄茎叶；因此，当枇杷茎叶的半纤维素被快速利用之后，其中的部分纤维素被水解产酸菌水解生成能被产甲烷菌利用的底物，并在第一个产气稳定期后出现了第二个产气峰值和稳定期。

总体来看，本研究中生物质厌氧产生的沼气和甲烷量与底物中的半纤维素含量正相关，半纤维素对底物产气的贡献率达70%以上，即半纤维素在底物产气潜力预测中的权重可达70%；因此，通过分析测定底物中的半纤维素含量就能够基本预测该底物的产气潜力。纤维素对底物产气的贡献率与生物质材料种类密切相关，但其产气贡献权重小于半纤维素。木质素对有机底物产气的贡献权重几乎为0。