高效液相色谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中的维生素A、D3、E和β-胡萝卜素

□ 吴新文 贵州省流通环节食品安全检验中心 马 凯 贵州省分析测试研究院 张世芹 田 璞 贵州省流通环节食品安全检验中心

婴幼儿配方乳粉中的营养成分主要有蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和维生素等。维生素是维持人体生命活动必需的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质[1]。维生素A又名视黄醇，维生素A对于婴幼儿骨骼和视力的生长发育有很大的作用，维生素A不但可以维持正常的视觉功能，防止夜盲症，而且具有维持上皮细胞结构的完整与健康、促进机体正常生长发育、增强机体的造血功能和预防癌症等十分重要的功能[2]。维生素D主要包括维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）[3]。维生素D是人类生长发育过程中不可缺少的重要物质，维生素D缺乏不仅可导致钙的吸收利用降低，出现佝偻病、骨软化症、骨量减少及骨质疏松，而且可能导致免疫系统功能紊乱[4]；维生素E，是主要的抗氧化剂之一，可以帮助婴幼儿对抗外界的氧化压力，最大限度的利用婴幼儿自身的抵抗力对抗疾病，对婴幼儿的成长尤为重要[5]；β-胡萝卜素，经人体摄入，可以转化成维生素A，是目前最安全的补充维生素A的产品，它可以维持眼睛和皮肤的健康，改善夜盲症、皮肤粗糙的状况，有助于帮助身体免受自由基的伤害[6]。

目前，测定维生素A、D3、E和β-胡萝卜素的方法主要有紫外分光光度法、薄层层析法、荧光法、气相色谱法和高效液相色谱法等[1-13]，由于高效液相色谱法具有快速、准确、稳定性高及可同时测定多种维生素等优点而被广泛应用，用高效液相色谱法测定维生素A、D3、E和β-胡萝卜素，一般需要对样品进行皂化、萃取、浓缩等步骤，维生素A和E浓缩后可直接通过反相液相色谱测定，但维生素D3浓缩后直接通过反相液相色谱测定，样品杂质干扰较大，定性、定量都不准确[1-13]。本文通过优化样品的前处理条件和仪器色谱条件[1-12]，采取统一皂化萃取，分两部分进行浓缩，一部分浓缩后直接通过反相液相色谱仪同时测定维生素A和E，另一部分浓缩后先经正相液相色谱仪，根据保留时间收集维生素D3和β-胡萝卜素馏分，再次浓缩后，通过反向液相色谱仪同时测定维生素D3和β-胡萝卜素，建立了一种同时测定婴幼儿配方乳粉中维生素A、D3、E和β-胡萝卜素的方法。该方法提高了实验室的检测效率，同时降低了检测成本，为婴幼儿配方乳粉的安全监管提供技术支撑 。

1 实验部分

1.1 实验仪器

Agilent 1290高效液相色谱仪，配置DAD检测器，自动进样器（配有20μL样品环）；Agilent 1100高效液相色谱仪，配置VWD检测器，手动进样器（配有500μL样品环）；氮吹仪等。

1.2 标准物质与试剂

标准品：维生素A纯度≥98%、维生素E（α-生育酚纯度≥96%、β-生育酚纯度≥98%、γ-生育酚纯度≥96%及σ-生育酚纯度≥96%）、维生素D3纯度≥98%、β-胡萝卜素纯度≥97%。

试剂：氢氧化钾（分析纯）、甲醇（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、石油醚（分析纯）、乙醚（分析纯）、抗坏血酸（分析纯）、无水硫酸钠（分析纯）、正己烷（色谱纯）、环己烷（色谱纯）、异丙醇（色谱纯）和超纯水（自制）。

1.3 标准溶液的配制

分别称取标准物质维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚、维生素D3及β-胡萝卜素25.0 mg于不同的小烧杯中，加无水乙醇溶解，再用无水乙醇分别转移至50 mL容量瓶中，配制成浓度为500 μg/mL的标准溶液，4 ℃ 避光保存1个月。

1.4 样品前处理

样品皂化。取20 g样品于250 mL皂化瓶中，加入5 g抗坏血酸，100 mL无水乙醇，50 mL浓度为50%的氢氧化钾溶液，摇匀后，在85 ℃恒温磁力搅拌水浴锅中回流皂化30 min，皂化后立即取出，放入冰水浴中冷却。

样品萃取。将皂化液转移入500 mL分液漏斗中，用100 mL水分3次洗涤皂化瓶，洗液并入分液漏斗，加入100 mL石油醚+乙醚（1+1）混合溶液，振摇萃取5 min，静置分层，下层液体转移到另一个分液漏斗中，加100 mL石油醚+乙醚（1+1）混合溶液重复萃取一次，弃去下层液体，合并醚层到一个分液漏斗中，用200 mL水洗醚层，轻轻振摇，防止乳化，静置分层，弃去水层，重复3次。

脱水定容。将醚层过无水硫酸钠脱水，用石油醚洗涤并定容至250 mL。

浓缩定容。取100 mL上述定容液，50 ℃氮气吹干，加入5 mL无水乙醇溶解，过膜，通过反相高效液相色谱仪，测定维生素A和维生素E。另取100 mL上述定容液，50 ℃氮气吹干，加入2 mL正己烷+环己烷（1+1）并按体积分数0.8%加入异丙醇的混合溶液溶解备用。

馏分收集。取上述备用液500 μL注入正相高效液相色谱仪中，根据维生素D3和β-胡萝卜素的保留时间收集其馏分于同一试管中。

浓缩。将上述馏分，50 ℃氮气吹干，加入200 μL无水乙醇溶解，反相高效液相色谱梯度洗脱测定维生素D3和β-胡萝卜素。

以上实验都在避光环境下进行。

表1 维生素D3和β-胡萝卜素梯度洗脱程序

图1 皂化温度的选择

图2 皂化时间的选择

1.5 色谱条件

1.5.1 正相高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX RX-SIL（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：正己烷+环己烷（1+1）并按体积分数0.8%加入异丙醇；柱温：25℃；进样量：500 μL；VWD检测器波长：0 min选择450 nm，7 min切换成294 nm，在3～6 min收集β-胡萝卜素，在12～15 min的收集维生素D3，收集于同一试管中。

1.5.2 反相高效液相色谱条件

1.5.2.1 维生素A和E的测定

色谱柱：Agilent Poroshell 120 PFP（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流动相：甲醇+水（88+12）；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；DAD检测器波长：325、296 nm。

1.5.2.2 维生素D3和β-胡萝卜素的测定

色谱柱：Agilent Poroshell 120 PFP（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流动相：甲醇+水；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；DAD检测器波长：450 nm和264 nm；梯度洗脱见表1。

2 结果与讨论

2.1 皂化温度的选择

乳粉中蛋白质含量为60%左右，考虑到要检测的维生素可能被蛋白包裹，需要对奶粉进行皂化处理，皂化温度很可能会影响各种维生素的提取率。现取同时含有维生素A、维生素E、维生素D3和β-胡萝卜素的婴幼儿配方乳粉进行实验，分别在55、65、75、85 ℃及95 ℃下皂化30 min，其他条件同1.4一致，重复做3次实验，计算平均结果，结果如图1所示，温度从55 ℃升到85℃时，样品中各种维生素检出值都有不同程度的提升，但温度从85 ℃升到95℃时，样品中各种维生素的检出值都基本保持不变，因此选择皂化温度为85 ℃。

2.2 皂化时间的选择

皂化时间的长短对维生素的检出值也有一定影响，时间太短皂化不完全，目标物可能依然被包裹，时间太长，既浪费时间又有可能使目标物氧化或分解，增加了不可控因素。现取同一样品分 别 皂 化10、20、30、40 min及50 min，其他条件同1.4一致，重复做3次实验，计算平均结果，结果如图2所示，皂化时间从10 min延长到30 min时，样品各个目标物的检出量都有不同程度的提高，从30 min延长到50 min，样品各个目标物的检出量基本保持不变，因此选择皂化时间为30 min。

2.3 萃取溶剂的选择

为了选择适合各种维生素的萃取溶剂，取同一样品，按1.4的实验方法皂化，分别用石油醚、正己烷、石油醚+乙醚萃进行萃取，重复3次，计算平均结果，结果如图3所示，用石油醚+乙醚萃取时，样品各个目标物的检出量都为最高，因此选择使用石油醚+乙醚进行萃取。

图3 萃取溶剂的选择

图4 维生素D3和β-胡萝卜素标样和样品图谱（正相）

图5 维生素A和维生素E标样和样品图谱

图6 维生素D3和β-胡萝卜素图谱（反相）

2.4 色谱条件的选择

2.4.1 正相液相色谱条件的选择

流动相参考GB 5009.82-2016[13]选择正己烷+环己烷（1+1），并按体积分数0.8%加入异丙醇；柱温会影响各物质的保留时间，柱温太高时，各物质出峰太快，目标物与杂质的分离度不够，接收馏分时，杂质干扰太大，不利于反相液相色谱分离；柱温太低时，各物质出峰时间太晚，导致资源浪费，同时也降低了检测效率，25℃刚好能满足实验要求；β-胡萝卜素和维生素D3馏分接收时间太短会导致接收不完全，时间太长接收的杂质太多，不利于反相液相色谱分析，标样和样品各物质的保留时间如图4所示，经过验证，在3～6 min内接收β-胡萝卜素馏分，在12～15 min内接收维生素D3馏分，按1.4步骤处理后能满足实验要求。

2.4.2 反相液相色谱条件的选择

流动相参考GB 5009.82-2016[13]选择甲醇+水；维生素A和维生素E的测定采用等度洗脱，流动相中甲醇的比例太高或太低都会影响杂质和各目标物之间的分离度，选择甲醇+水（88+12）洗脱，标样和样品图谱如图5所示，各目标物之间的分离度良好，样品基本无杂质干扰，定量准确。维生素D3和β-胡萝卜素的测定采用梯度洗脱，对极性相差大的目标物采用等度洗脱时，目标物的峰型差而且分离度不好、分析速度慢，采用如表1所示的梯度洗脱程序，标样和样品图谱如图6所示，维生素D3和β-胡萝卜素的峰型和分离度良好，样品基本无杂质干扰，分析速度快。

2.5 实际样品检测结果

本研究对3个品牌一共30批次的婴幼儿配方乳粉进行测定，维生素A含量为 450～ 520 μg/100 g、维生素 D3含量为7.8～12 μg/100 g、维生素E含量为4.8～ 8.2 mgα-TE/100 g、β-胡萝卜素含量为59～96 μg/100 g。含量均符合国家要求。

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围和检出限

以上述各种物质的峰面积和浓度计算回归方程，选择最优的条件下进行实验，在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数R2＞0.999 3；通过S/N=3计算得出奶粉中维生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚、维生素D3及β-胡萝卜素的检出限，结果如表2所示。

2.6.2 回收率和精密度

各类维生素都选择3个水平加标，每个水平做6次加标回收实验，各类维生素平均回收率均在95.2%～98.5%；对各类维生素每个水平的6次加标回收实验的实验结果进行精密度计算，各类维生素的精密度均在1.5%～4.7%。以上结果如表3所示。

表2 检出限和线性范围

表3 回收率和精密度

3 结论

本文对婴幼儿配方乳粉中维生素A、D3、E和β-胡萝卜素测定过程中的皂化温度、皂化时间、萃取溶剂和仪器色谱条件等因素进行研究后，建立了高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中维生素A、D3、E和β-胡萝卜素的方法。样品经皂化处理后，用石油醚+乙醚萃取、定容，取一部分萃取液浓缩后，直接上反相液相色谱，测定维生素A和维生素E，另一部分浓缩后，先上正向液相色谱净化，根据保留时间收集维生素D3和β-胡萝卜素馏分，再次浓缩后上反相液相色谱测定维生素D3和β-胡萝卜素。该方法稳定、准确，能满足检测要求。适用于婴幼儿配方乳粉中维生素A、D3、E和β-胡萝卜素含量的测定。