野菊花水提物对胰岛素通路突变体果蝇发育及代谢功能的影响

张月，金丽华

(东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

糖尿病是机体内胰岛素分泌或利用缺陷长期使葡萄糖积累在循环血液中，机体代谢平衡被破坏所引起的一种慢性疾病[1]，伴有多种并发症如视网膜、肾脏、血管、神经等功能性病变[2]。其中2型糖尿病最为常见，且发病率逐年上升[3-4],已经严重影响人们的健康。目前的治疗手段主要是通过药物控制血糖的升高，比如注射胰岛素或口服降糖的药物等，用于防治相关的并发症。然而此类药物存在一定的副作用[5-6]。

中草药毒副作用小、成本低廉、应用前景广泛[7]。因此中医药对于糖尿病的治疗越来越得到重视。野菊花为菊科多年生草本植物，以干燥头状花序入药，是我国传统药用植物之一。主要化学成分包括萜类、黄酮类化合物、酚类等，具有抗炎、清热解毒、降血压等功效[8-9]。我们之前的研究发现野菊花水提物可以缓解果蝇中由高糖饮食诱导的代谢紊乱及生长缺陷[10]，但野菊花在治疗糖尿病方面的作用仍知之甚少。

果蝇调控葡萄糖稳态的机制与人类非常相似，可作为研究2型糖尿病的重要模式生物，它的胰岛素生理功能主要通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径发挥作用[11-12]。该途径中的任何环节异常都可能导致胰岛素抵抗，进而使机体糖代谢稳态失衡[13-14]。

研究发现果蝇chico及S6k的突变均导致个体体质量下降，并且影响细胞的代谢[15]。本实验通过对chico和S6k突变体的蛹壳体积、成虫体质量、脂肪体油滴大小、翅膀面积及单位面积内翅膀细胞数方面的分析，研究喂食野菊花水提物对突变体果蝇生长发育及代谢功能的影响，为开发治疗2型糖尿病的药物提供理论基础。

1 材料

1.1 药材与试剂

野菊花(FlosChrysanthemiIndici, CI)头状花序，购买于黑龙江省哈尔滨市人民同泰大药房，由东北林业大学生命科学学院冯富娟教授鉴定。氟硼二吡咯(Boron-dipyrromethe, BODIPY)、鬼笔环肽(Phalloidin)购自于Life Technologies公司。

1.2 实验动物

野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)w1118为本实验室保存，突变体果蝇chico1/CyO及S6kl-1/TM6B由Tian Xu教授提供。果蝇培养温度(25±1)℃，相对湿度60%～70%。

1.3 仪器

ALC-210.4型电子分析天平，北京赛多利斯公司；Elix5型纯化水系统，美国Millipore公司；SZ51型显微镜，日本Olympus公司；Axioskop 2 plus型荧光显微镜，德国Zeiss公司。

2 方法

2.1 野菊花水提液的制备

称取20 g野菊花放入圆底烧瓶，加200 mL去离子水浸泡12 h，大火加热煮沸后微火熬制3 h，纱布过滤收集滤液；滤渣再次加入200 mL去离子水同样方法熬制3 h，收集两次滤液浓缩至100 mL，得到质量浓度为0.2 g/mL(20%)的野菊花水提液，室温冷却后置-40℃保存备用。

2.2 果蝇培养基的配制

对照组(正常培养基)：培养基配制方法参照文献方法[16]。

实验组(野菊花水提物培养基)：将对照组培养基中的去离子水替换成等体积的野菊花水提液，实验组培养基中野菊花的质量分数为10%(0.1 g/mL)。

2.3 果蝇蛹壳体积及体质量的测定

正常培养基中孵化的野生型果蝇和突变体果蝇作为对照组，10%野菊花水提物培养基中孵化的突变体果蝇作为实验组。将已经孵化出成虫果蝇的蛹壳放置于载玻片上，用毛刷蘸取甘油将其固定摆放整齐，每组分别收集30个蛹壳在显微镜下照相，利用ImageJ软件测量蛹壳的长和宽后用公式计算体积并进行比较。公式：4/3π(L/2)(l/2)2(L，长度；l，宽度)[17]。随机收集羽化24 h以内的成虫果蝇，雌雄分开，每组各30只，装入已称量好的EP管中在电子天平上称量果蝇的体质量。每组重复5次计算平均体质量进行比较。

2.4 BODIPY和Phalloidin染色

室温下每组果蝇随机提取15～20只三龄幼虫脂肪体于4%多聚甲醛中固定30 min，用PBST(PBS+0.1% Tween20)将组织清洗3次，每次5 min，然后在分别在Phalloidin和BODIPY中各染色30 min，DAPI染色10 min，每次染色后分别用PBST将组织清洗3次，每次5 min，最后slowfade封片在荧光显微镜下观察拍照。利用ImageJ软件测量脂肪体细胞大小和脂滴面积。

2.5 成虫翅膀面积的测定

每组随机收集20只雄果蝇翅膀，用石蜡油将其固定于载玻片上摆放整齐，显微镜下照相后利用Image J软件测量分析。

2.6 统计学处理

采用Prism软件进行统计学分析，组间差异采用单因素方差(one-way ANOVA)分析。

3 结果

3.1 对胰岛素通路突变体果蝇个体大小的影响

为分析野菊花水提物对于突变体果蝇个体大小的影响，我们分别收集喂食不同培养基果蝇的蛹壳，显微镜下照相后计算其体积进行比较。结果表明，与野生型果蝇相比，chico1/CyO突变体蛹壳体积减少了27.7%，当突变体果蝇喂食10%野菊花后蛹壳体积显著增加17%(图1A-B)，说明喂食野菊花提取物可明显缓解chico1/CyO突变体蛹壳体积减小的情况。

另外，胰岛素信号传导途径中S6k是chico下游的基因，我们过去的研究发现野菊花水提物可以改善S6kl-1/TM6B突变体的生长缺陷[10]，这里我们对此进行了验证。S6kl-1/TM6B突变体与野生型果蝇相比蛹壳体积减少了21.9%，当突变体喂食10%野菊花后蛹壳体积显著增加23.6%(图1C-D)，与过去的结论一致。说明野菊花水提物对chico1/CyO以及S6kl-1/TM6B突变体果蝇蛹壳体积减小情况均有明显的缓解作用。

图1 野菊花水提物对突变体果蝇蛹壳体积的影响(n=30)

3.2 对胰岛素通路突变体果蝇体质量的影响

由于胰岛素通路基因发生突变以后，个体显著变小。因此，我们进一步分析了野菊花水提物对突变体果蝇成虫体质量的影响。结果显示，与野生型果蝇相比，chico1/CyO雌果蝇体质量降低11%，雄果蝇体质量降低26.9%。当突变体喂食10%野菊花后，雌果蝇体质量无明显变化，但是，雄果蝇体质量显著增加35.6%(图2A-B)。

另外，我们也对之前研究发现的S6kl-1/TM6B突变体喂食10%野菊花后体质量进行了验证，得到一致的结论。与野生型果蝇相比，S6kl-1/TM6B雌果蝇体质量降低了20.5%，雄果蝇体质量降低24.2%。当突变体果蝇喂食10%野菊花后，雌果蝇体质量变化不明显，雄果蝇体质量显著增加32%(图2C-D)。结果表明野菊花水提物可以提高chico1/CyO和S6kl-1/TM6B突变体雄果蝇成虫体质量。

图2 野菊花水提物对突变体果蝇体质量的影响(n=150)

3.3 对S6kl-1/TM6B突变体果蝇翅膀大小的影响

个体变小主要是由于各个组织器官变小引起的，因此，我们进一步探究野菊花水提物对突变体果蝇翅膀大小的影响。我们对之前研究的S6kl-1/TM6B突变体喂食野菊花后翅膀面积进行了验证，研究结论一致。与野生型果蝇相比，S6kl-1/TM6B突变体翅膀面积及单位面积内翅膀细胞数分别减少了11.8%和14%。当突变体果蝇喂食10%野菊花后翅膀面积显著增加11.5%，单位面积内细胞数增加9.4%(图3A-D)。说明野菊花水提物可以改善果蝇S6k突变后翅膀面积变小及单位面积内翅膀细胞数量减少的情况。

图3 野菊花提取物对S6kl-1/TM6B突变体 果蝇翅膀大小的影响(n=20)

3.4 对胰岛素通路突变体果蝇脂肪代谢的影响

以上结果表明野菊花水提物可以缓解突变体果蝇的生长缺陷。为进一步探究野菊花水提物对突变体果蝇细胞大小以及脂肪代谢的影响，我们对果蝇的脂肪体细胞进行了分析。结果显示，与野生型果蝇相比，chico1/CyO突变体脂滴面积、细胞核大小以及脂肪体细胞面积均显著减小。当突变体喂食10%野菊花后，脂滴面积、细胞核以及脂肪体细胞面积分别显著增加了30.4%、32%、28.6%(图4A-D)。

另外我们之前的研究发现S6kl-1/TM6B杂合体喂食10%野菊花水提物后可以改善脂肪代谢，增加细胞大小。这里我们利用S6k纯合突变体果蝇的脂肪体细胞进行了进一步分析。与野生型果蝇相比，S6kl-1/S6kl-1突变体果蝇脂滴面积、细胞核大小以及脂肪体细胞面积均显著减小。当S6kl-1/S6kl-1喂食10%野菊花水提物后，其脂滴面积、细胞核以及脂肪体细胞面积分别显著增加44%、33.7%、28.1%(图4A-D)。说明野菊花水提物均能够明显改善突变体chico1/CyO及S6kl-1/S6kl-1的脂肪细胞大小减小及脂肪体代谢贮存情况。

图4 野菊花水提物对突变体果蝇幼虫 脂肪体细胞的影响(n=15～20)

4 讨论

近年来，中医对治疗糖尿病的中药进行了广泛的研究，但每种中草药的作用机理不同[18]。野菊花作为我国传统药用植物之一，具有抑菌、抗病毒、降血压等功效被广泛用于治疗多种疾病[19]，且毒副作用小、安全、来源广、成本低等优点是西药所不具备的。果蝇胰岛素信号传导途径与哺乳动物具有高度的保守性[20]，所以利用果蝇模型快速筛选治疗糖尿病的中药。果蝇中控制能量代谢的相互拮抗两条信号通路：胰岛素信号通路(insulin pathway)和脂动激素(AKH)信号通路，负责管理能量的流动运输和互换，即糖类和脂类物质[21]，果蝇中胰岛素信号传导与脂肪代谢紧密相关[22]。

本实验通过对胰岛素通路突变体果蝇喂食野菊花水提物后生长状态以及脂肪贮存等方面进行分析，表明突变体喂食野菊花水提物后蛹壳体积、体质量、脂肪代谢情况及翅膀面积均得到了明显的改善。说明野菊花水提物对于胰岛素通路突变体果蝇的生长缺陷有一定的缓解作用，但具体影响果蝇发育代谢的机制以及野菊花水提物针对抗糖尿病方面的具体药理药性仍然需要进一步的实验研究。我们的结果为野菊花在治疗糖尿病方面的开发和利用提供新的思路。