电解水在利用虾壳提取甲壳素中的应用研究

韩晓梅，吴小禾，李文亚，孙一丹，桑亚新，孙纪录，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.中山火炬职业技术学院生物医学系，广东 中山 528436）

随着人工养殖的发展，我国虾产量逐年递增，在加工或食用过程中产生大量的虾壳。长期以来，虾壳除少量被低值化利用之外，多是作为垃圾扔掉，既浪费资源，又污染环境。甲壳素（chitin）又称几丁质，广泛存在于甲壳类动物中[1]，如，虾壳中甲壳素含量高达20%～25%[2]。甲壳素是一种高分子的糖化合物，吸湿性强，能够吸附重金属离子，无毒无味，可以作为填充剂、稳定剂、脱色剂等，已在医药、农业、轻纺、环保等领域广泛应用[3-5]。

目前，甲壳素的提取及其衍生物的制备广受关注[6-9]。在工业上，从虾壳中提取甲壳素，主要过程为在机械搅拌下用盐酸脱钙，用碱脱蛋白质[10]。然而，在脱钙的同时，盐酸会破坏甲壳素分子结构[11]，并且酸碱用量大，洗涤用水多，大量酸碱液排放造成严重的环境污染[12]。电解水通过电解稀盐（通常是NaCl）溶液产生[13-14]。从阴极得到的碱性部分被称为碱性电解水（basic electrolyzed water，BEW），其 pH 值可达 11 左右。同时从阳极获得的酸性部分被称为酸性电解水（acidic electrolyzed water，AEW），其 pH 值可达 2.6 左右[15]。关于电解水的应用，已有诸多研究报道[16-18]。目前，AEW 主要作为一种杀菌剂[19-20]。电解水对人体健康和环境无害，安全性好，可现场生产，操作简便，价格低廉[21]。AEW 和BEW 与传统工艺中使用的盐酸和氢氧化钠在酸碱性方面具有极高的相似性，有潜力部分取代甚至完全取代它们。本文拟采用AEW 和BEW 处理虾壳进行脱矿物质和脱蛋白的系统研究，以期开发一种新型的绿色环保的提取甲壳素工艺方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾壳：东方对虾虾壳，购自河北省黄骅市，清洗，50 ℃电热鼓风干燥器中干燥12 h，粉碎，分级过筛（40、60、80、120 目）。

氯化钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）、硝酸（分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂；过氧化氢（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；铅单元素标准溶液、砷单元素标准溶液：国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.2 仪器与设备

电解水发生器：河北农业大学食品科技学院食品微生物学实验室自制；XL-100 型马弗炉：河南市鹤壁亿欣仪器仪表有限公司；JJ-1 型电动搅拌器：常州国宇仪器制造有限公司；SU8010 型扫描电子显微镜：Hitachi；FW100 型高速万能粉碎机、WGL-125B 型电热鼓风干燥器：天津市泰斯特仪器有限公司；6200 型热重-卡量计双重分析仪：东莞市好迈电子科技有限公司；Spectrum65 型傅里叶红外光谱仪：上海航欧机电设备有限公司；7700x 型电感耦合等离子体质谱仪：苏州工业园区三源芯辉电子科技有限公司；TANK 型微波消解仪：济南海能仪器股份有限公司；ZEEnit 700P 型火焰原子吸收器：德国耶拿分析仪器股份公司；AS-1型Pb 原子吸收空心阴极灯：北京有色金属研究总院。

1.3 方法

1.3.1 酸性电解水批次处理虾壳脱矿物质研究

用1%NaCl 溶液制备电解水，电压为20 V，从酸性电解槽中获得酸性电解水，用于批次处理虾壳粉。按0.1 g/mL 的比例，在虾壳粉中加入酸性电解水，在30 ℃、180 r/min 摇床上进行反应，直至无气泡产生；测定反应后溶液的pH 值；然后，将残渣洗涤至中性，5 000 r/min 离心10 min。将残渣于60 ℃干燥8 h，测定残渣的重量和灰分含量。

1.3.2 酸性电解水连续处理虾壳脱矿物质研究

向电解水发生器的酸性、碱性电解槽中分别加入1 L 的 1%（或 0.1%）NaCl 溶液，称取 20 g120 目的虾壳粉放入到酸性电解槽中，搅拌10 min，测定起始pH值。然后进行电解，电压为20 V，不断搅拌，处理6 h。抽滤，除去电解液，然后将残渣洗涤至中性，5 000 r/min离心10 min，于60 ℃干燥8 h，测定残渣的质量和灰分含量。

1.3.3 酸性电解水处理虾壳节约盐酸使用量的效果评价

取120 目虾壳粉20 g 于烧杯，边搅拌边缓慢加入1 mol/L 盐酸，当pH 值下降至1 左右时，脱矿物质结束，记录盐酸使用量。将残渣洗涤至中性，5 000 r/min离心10 min，于60 ℃下干燥8 h，测定残渣的质量及其灰分含量。称取相同质量的虾壳粉，使用1%（或0.1 %）的NaCl 溶液制备的AEW 连续处理，处理结束后，抽滤除去电解液，将虾壳粉残渣洗涤至中性，5 000 r/min 离心10 min，收集残渣。向得到的残渣中加入1 mol/L 盐酸，继续处理。当pH 值下降至1 左右时，脱矿物质结束，记录盐酸使用量。比较以上两种处理方式的盐酸使用量，即可评价酸性电解水处理虾壳节约盐酸用量的效果。

1.3.4 碱性电解水在虾壳脱蛋白质中的应用研究

向电解水发生器的酸性、碱性电解槽中分别加入1 L 的 1%（或 0.1%）NaCl 溶液，称取 20 g120 目的虾壳粉放入到碱性电解槽中，搅拌10 min，测定起始pH值。然后进行电解，电压为20 V，不断搅拌，反应6 h。反应结束后，过滤电解液，将虾壳粉残渣洗涤至中性，5 000r/min 离心10min。将所得残渣于60 ℃下干燥8 h，测定残渣的质量，蛋白质含量，并计算蛋白质脱除率。

1.3.5 传统无机酸碱法制备甲壳素

取120 目虾壳粉20 g 于烧杯，边搅拌边缓慢加入1 mol/L 盐酸，当pH 值下降至1 左右时，脱矿物质结束。然后，过滤洗涤。向滤渣中加入一定量的2 mol/L NaOH 溶液，于70 ℃下反应4 h，以除去所有蛋白质。过滤，将残渣洗涤至中性，5 000 r/min 离心10 min，再于60 ℃下干燥8 h，即得甲壳素。

1.3.6 酸性电解水和碱性电解水联合处理虾壳提取甲壳素研究

1）先酸性电解水后碱性电解水联合处理从虾壳中提取甲壳素：向电解水发生器的酸性、碱性电解槽中分别加入1 L 的1%NaCl 溶液，称取20 g 120 目的虾壳粉放入到酸性电解槽中，进行电解，反应6 h，反应结束后，过滤电解液，将残渣洗涤至中性，5 000 r/min 离心10 min。然后，将残渣置于碱性电解槽中，反应6 h，反应结束后，过滤并洗涤至中性，5 000 r/min 离心10 min，再于60 ℃下干燥8 h，从而制得甲壳素，测定甲壳素的收率以及灰分含量和蛋白质含量。

2）先碱性电解水后酸性电解水联合处理从虾壳中提取甲壳素：为了进一步考察AEW 与BEW 处理顺序对提取甲壳素的影响，交换1.3.6 章节1）中AEW 和BEW 对虾壳的处理顺序，其他条件不变，制得甲壳素，并测定甲壳素的收率以及灰分含量和蛋白质含量。

1.3.7 甲壳素的理化性质检测

1）灰分含量的测定：参照国标GB5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》。

2）蛋白质含量及脱除率的测定：参照韩晓梅等的方法[22]。

3）水分的测定：采用直接干燥法，参照国标：GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》。

4）砷含量的测定：检测模式，氦模式；流速，5.0 mL/min；标准品配制，将砷元素标准品溶液用5%硝酸溶液稀释到 2、4、8、12、16、20 μg/L；样品处理，称取约50 mg 样品于微波消解管中，加入5 mL 硝酸，同时做样品空白，运行微波消解程序，消解结束，100 ℃，100 min 赶酸，放至室温，用稀释液定容到50 mL，上机检测，绘制砷元素标准曲线，如图1所示。

5）铅含量的测定：吸取铅标准储备液5.00 mL 于100 mL 容量瓶中，用 1 mol/LHNO3定容至100 mL，制备50 μg/mL 铅标准使用液。吸取铅标准使用液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL，分别置于 100 mL 容量瓶中，用1 mol/L HNO3定容，配制成标准工作液系列，其中铅浓度分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μg/mL。称取1.000 g 试样于消解罐中，加6.0 mL 硝酸、2.0 mL 过氧化氢（30%），混合均匀，于微波消化仪中消化，消解完成后，自然冷却至室温，开盖赶酸，将消化液洗入10 mL容量瓶中，用水少量多次洗涤罐，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混匀备用，同时做试剂空白试验。将制备好的铅标准工作液、空白溶液和试样溶液分别导入空气-乙炔火焰原子吸收分光光度计中，以铅元素空心阴极灯为光源，在波长283.3 nm 处调整仪器于最佳工作状态，分别测定各自的吸光度。以标准工作液中铅浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。

图1 砷元素含量标准曲线Fig.1 The standard curve of arsenic content

图2 铅元素含量标准曲线Fig.2 The standard curve of lead content

6）扫描电镜分析：取分散好的甲壳素样品微量，置于铜片上，干燥，将载有样品的铜片粘在导电胶带上，置于蒸金室中，进行蒸镀导电层处理。制作好试样后，用导电胶固定试样在载物台上，抽真空，调整试样的距离和最佳倍数，选择不同的倍数，观察。

7）热重分析及差热分析：采用非等温动态热重法，设定升温范围为30 ℃～650 ℃，升温速率为10 ℃/min，测定质量随温度的变化情况。差热分析试验设定的升温范围为 30 ℃～650 ℃，升温速率为 10 ℃/min，记录样品和参比物间的温度差随着温度变化的情况。

8）傅里叶红外光谱分析：光谱分辨率为4 cm-1，扫描次数为 4 次，扫描范围为 4 000 cm-1～400 cm-1，试样为KBr 压片。

2 结果与分析

2.1 酸性电解水对虾壳的脱矿物质的作用

2.1.1 酸性电解水批次处理对虾壳的脱矿物质作用

将不同目数的虾壳粉按0.1 g/mL 的比例加入到AEW 中进行处理。测定AEW 的起始pH 值和反应之后的pH 值，并测定样品杂质脱除率及其灰分含量，结果见表1。

表1 AEW 批次处理虾壳的脱矿物质效果Table 1 The efficacy of demineralization of shrimp shell by AEW batch treatment

由表1可见，不同粒径大小的虾壳粉经过AEW批次处理后，溶液的pH 值均由最初的2.34 上升到8.20 左右，样品的灰分含量保持在55%左右，表明AEW 批次处理时所能提供的H+非常有限，不能有效实现脱除矿物质作用。

2.1.2 酸性电解水连续处理对虾壳的脱矿物质作用

分别用0.1%和1%的NaCl 溶液制备电解水，在酸性电解槽中加入一定量的虾壳粉，连续电解，保持H+的不断产生。6 h 处理结束后，测定残渣的质量及其灰分含量。结果表2所示。

表2 AEW 连续处理虾壳的脱矿物质效果Table 2 The efficacy of demineralization of shrimp shell by AEW continuous treatment

如表2所示，用1%NaCl 制备的AEW 对虾壳处理后灰分含量为1.14%，较虾壳样品减少了97.80%，杂质脱除率为57.00%，相比之下，用0.1%NaCl 制备的AEW 对虾壳脱矿物质效果较差。与盐酸对虾壳处理后灰分含量0.97%相比，酸性电解水脱矿物质效果良好，盐酸进一步处理即可彻底脱除矿物质。

2.1.3 酸性电解水连续处理虾壳粉脱矿物质方法的节约盐酸效果评价

使用AEW 作为预处理与盐酸结合对虾壳粉处理，与单独使用盐酸处理进行比较，盐酸的节约效果如表3所示。

表3 AEW 连续处理虾壳脱矿物质方法的盐酸节约效果Table 3 The efficacy of hydrochloric acid saving for demineralization of shrimp shell by AEW continuous treatment

由表3可知，处理相同的虾壳粉20 g，单纯使用盐酸处理，需要消耗1 mol/L HCl 为182 mL。用1%NaCl制备的AEW 连续处理后，再将残渣继续用1 mol/L HCl 处理，消耗盐酸量为6.40 mL，与单纯用盐酸处理相比，可以节省盐酸使用量96.48%。而经过0.1%NaCl 制备的AEW 连续处理后，再用盐酸处理，节省盐酸用量60.99%。由此可见，使用AEW 连续处理虾壳粉，既可达到单纯使用盐酸脱矿物质的程度，又在很大程度上减少了盐酸的用量。

2.2 碱性电解水连续处理对虾壳的脱蛋白质作用

分别用0.1%和1%的NaCl 溶液制备电解水，在碱性电解槽中加入一定量的虾壳粉，连续电解。6 h 处理结束后，测定残渣的重量和蛋白质含量及其脱除率，结果如表4所示。

表4 BEW 连续处理虾壳的脱蛋白效果Table 4 The efficacy of deproteinization of shrimp shell by BEW continuous treatment

由表4可知，经过1%NaCl 制备的BEW 处理后，残渣的蛋白质含量减少为17.79%，蛋白质脱除率达到66.75%，经1%NaCl 制备的BEW 的脱蛋白效果要高于0.1%NaCl 制备的BEW。同时，虽然用高浓度电解质制备的BEW 脱蛋白效果更好，但是蛋白质并没有完全脱除，这可能是由于存在于角质层中的矿物质会影响脱蛋白效率。通常在节肢动物角质层，甲壳素分子被蛋白质包裹形成纳米纤维，聚集形成甲壳素蛋白纤维，并联形成平面阵列组织，而矿物质则是维持刚性结构，所以，在没有经过脱矿物质处理时，矿物质的存在可能会影响蛋白质的脱除。

2.3 酸性、碱性电解水联合处理虾壳提取甲壳素研究

2.3.1 酸性、碱性电解水联合处理虾壳提取甲壳素工艺研究

在AEW、BEW 联合处理虾壳提取甲壳素工艺中，研究了AEW 与BEW 的处理顺序对提取甲壳素的影响，并与传统无机酸碱法提取的甲壳素进行了比较，对所获得的甲壳素的常规指标进行检测，结果如表5所示。

表5 AEW 和BEW 联合处理虾壳提取甲壳素的常规指标Table 5 Standard test results of chitin extracted from shrimp shell by AEW and BEW combining treatment

由表5可知，先用AEW 脱矿物质、后用BEW 脱蛋白连续工艺处理虾壳提取甲壳素，其蛋白质脱除率能达到97.99%，灰分含量为0.97%，水分含量为4.82%，接近传统无机酸碱法提取的甲壳素，符合国家标准GB 29941-2013《食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素（壳聚糖）》，此时提取率为19.46%。交换AEW 和BEW 的处理顺序后，提取的甲壳素粗品的脱矿物质和脱蛋白程度均有所下降。

2.3.2 甲壳素产品的质量评价

对AEW→BEW 连续处理虾壳提取的甲壳素进行质量检测，结果如表6所示。

表6 先AEW 后BEW 连续处理虾壳提取的甲壳素的质量评价Table 6 Quality evaluation of chitin extracted from shrimp shell by AEW and BEW combining treatment

由表6可知，先用AEW 后用BEW 连续处理获得的甲壳素为白色、粉末状固体，水分含量与灰分含量均达到食品级甲壳素的国家标准，铅、砷元素含量符合国家标准。

2.3.3 甲壳素产品的扫描电镜分析

通过扫描电镜分别对经过电解水处理和传统无机酸碱法从虾壳中提取的甲壳素进行观察，其表面形态如图3所示。

图3 甲壳素样品的扫描电镜图像（2000×）Fig.3 SEM images（2000×）of chitin

由图3可见，通过3 种方法提取的甲壳素都呈现疏松多孔的结构。相比于先用BEW 脱蛋白后用AEW脱矿物质提取的甲壳素（图C），AEW→BEW 处理顺序提取的甲壳素疏松程度更大（图B）。这表明在利用电解水提取甲壳素时，首先进行脱矿物质是必要的。在脱矿物质过程中，AEW 能够快速溶解虾壳内部的矿物质，而经过脱矿物质处理后的多孔结构更利于BEW深入到虾壳内部进行脱蛋白。

2.3.4 甲壳素产品的热重分析及差热分析

分别对不同方法提取的甲壳素进行热重分析和差热分析，并且与传统方法提取的甲壳素进行比较，其热重曲线与差热曲线如图4所示。

图4 甲壳素的热重分析及差热分析图Fig.4 TG and DTA analysis of chitin

如图4所示，对比A 图与B 图，分析TG 曲线可知，通过两种方法提取的甲壳素从室温到200 ℃升温过程中，首先去除物理结合水，当温度上升到250 ℃左右，甲壳素均出现α-松弛（即玻璃化转变），高聚物无定形部分从冻结状态变为解冻状态。随着温度的上升，DTA 曲线出现凹型曲线，表明甲壳素发生吸热反应，同时产生挥发性的水和CO2等低分子量的降解产物，因此样品的质量发生明显的下降。由此可见，传统方法与电解水处理提取的甲壳素随着温度的升高，理化性质发生了相同的变化。

2.3.5 甲壳素产品的傅里叶红外光谱分析

使用红外光谱对用电解水处理提取的甲壳素进行分析，并与传统无机酸碱法提取的甲壳素进行比较，结果如图5所示。

图5 甲壳素的红外光谱图像Fig.5 IR images of chitin

比较图5中的两个红外图像，二者都表现出了甲壳素的特征峰。甲壳素的红外光谱由一系列窄的吸收峰组成，具有典型的结晶多糖谱带。在3 480 cm-1附近的吸收峰属于O-H 伸缩振动，3 264 cm-1左右吸收峰是由于 N-H 的伸缩振动造成，2 960 cm-1～2 840 cm-1的吸收峰是属于C-H 伸缩振动。并且，图中还表现出三个显著的酰胺谱带，1 650 cm-1左右的吸收峰为酰胺Ⅰ谱带（C=O），1 555 cm-1左右的吸收峰为酰胺Ⅱ谱带（N-H），而1 310 cm-1左右的吸收峰为酰胺Ⅲ谱带（CN），1 020 cm-1～1 160 cm-1属于 C-O 伸缩振动所造成的吸收峰，898 cm-1左右是甲壳素环伸缩振动的吸收峰。红外光谱还可以用来区分甲壳素的不同晶型[23]，α-甲壳素的酰胺Ⅰ谱带被分裂成为两个吸收峰，分别位于1 656 cm-1和1 621 cm-1处，而β-甲壳素的酰胺Ⅰ谱带则是单峰，出现在1 626 cm-1。在酰胺Ⅱ谱带上，α-甲壳素的吸收峰出现于1 556 cm-1，而β-甲壳素的吸收峰出现于1 560 cm-1。图5中虾壳分别经过传统无机酸碱法和电解水连续处理提取的甲壳素的红外光谱图像均表现出α-甲壳素的特征吸收峰，表明通过两种方法提取出来的甲壳素均为α-甲壳素，同时也证明电解水法与传统酸碱法提取的甲壳素在结构上具有一致性。

3 讨论

本研究表明，先用AEW 脱矿物质后用BEW 脱蛋白的连续处理工艺从虾壳中提取甲壳素，提取率为19.46%，与舒晓红等采用酸碱交替法提取的甲壳素提取率18.56%比较相近[24]。Mukku Ghorbel-Bel-laaj Olfa等通过响应面法优化了绿脓杆菌A2 发酵条件后，虾壳的蛋白质与矿物质的脱除率分别是89%和96%[25]。利用鼠李糖乳杆菌与枯草芽孢杆菌两种菌发酵从虾壳中提取甲壳素，蛋白质和矿物质分别脱去85.45%和98.98%[26]。对比本研究结果，电解水处理能够有效的脱除虾壳中的蛋白质和矿物质，并且节约了大量的酸碱用量，同时避免了发酵法周期长的缺点。热重分析显示两种方法提取的甲壳素均在250 ℃左右出现α-松弛，质量迅速下降，这与Kim SS 等的研究结果相似，Kim SS 表明重量损失意味着α-松弛是由于模量的降低而产生，并且是由热分解引起[27]。本研究中两种方法提取的甲壳素的红外光谱图像都表现出了甲壳素的特征峰，与Pearson[28]和Tatsuya Setoguchi[29]等所研究的甲壳素红外光谱基本相似，并且显示提取物均为α-甲壳素。综上所述，电解水在利用虾壳制备甲壳素中具有极大的应用潜力。