硒对S. aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

毕崇亮，刘俊俊，王亨,3，王娟，韩照清，关立增

硒对诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

毕崇亮1，刘俊俊2，王亨2,3，王娟1，韩照清1，关立增1

（1临沂大学农林科学学院，山东临沂 276005;2扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；3江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协调创新中心，江苏扬州 225009）

【】硒（Se）能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤，有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌（）感染的奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响，从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【】首先将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中，当细胞超过80%的汇合度时，用含2、4和8 μmol·L-1浓度硒的培养基替换原来的培养基，继续孵育12 h，然后用PBS洗涤每孔3次，将按MOI=1:1的比例加入6孔板中，继续培养0.5 h，然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组，即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组，即Low组（bMECs+2 μmol·L-1Se+）、Mid组（bMECs+4 μmol·L-1Se+）和Hig组（bMECs+8 μmol·L-1Se+），每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK，AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，上样量为20 μg/孔，之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h，脱脂乳脱脂后用TBST清洗后，分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜，回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗，室温孵育2 h，回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次，最后在暗室条件下进行化学显影。【】能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK，AKT和mTOR蛋白磷酸化水平（＜0.01）。感染0.5 h后，Nod2蛋白水平显著升高（＜0.01）。在培养基里添加2 μmol·L-1的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（＜0.01），在培养基里添加8 μmol·L-1的硒可显著抑制Nod2的表达（＜0.05）；感染0.5 h后，RIP2蛋白水平显著升高（＜0.05），而在培养基里添加8 μmol·L-1硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（＜0.05）；感染0.5 h后，与对照组相比，模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（＜0.01）。在培养基里添加4 μmol·L-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（＜0.05），在培养基里添加8 μmol·L-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（＜0.01）；感染0.5 h后，与对照组相比，模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（＜0.01）。在培养基里添加4 μmol·L-1硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（＜0.01），在培养基里添加8 μmol·L-1硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（＜0.05）；感染0.5 h后，模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（＜0.01）。在培养基里分别添加4 μmol·L-1和8 μmol·L-1硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（＜0.05）。【】硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻诱导的bMECs炎症反应。

硒；金黄色葡萄球菌；Nod2/MAPK/mTORs；奶牛乳腺上皮细胞

0 引言

【研究意义】奶牛金黄色葡萄球菌（）性乳房炎是奶牛养殖业中常见疾病之一[1-2]。该病不仅造成奶产量和奶品质显著下降，给奶牛养殖业带来严重的经济损失，同时也严重威胁着人类的食品安全健康[3]。研究表明，金黄色葡萄球菌（）具备侵入到宿主细胞内部从而逃避宿主的胞外免疫攻击的能力，这为该病的治疗带来了巨大的困难[2]。奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）是乳腺组织抵御病原感染的第一道防线[4-5]。当感染发生时，bMECs可通过胞外模式识别受体快速识别胞外病原，进而免疫应答反应，而对于进入到胞内的病原则主要依赖于胞内模式识别受体[6]。Nod2近些年来新发现的一种胞内模式识别受体，研究Nod2受体及其介导的信号通路对于更好的理解胞内免疫反应具有重要的意义。本课题组前期研究发现Nod2可诱导多条信号通路的表达其中包括经典的炎症信号通路MAPK[7]。而MAPK信号通路中的核心蛋白JNK又是连接多条信号通路的枢纽，比如mTOR信号通路[8]。mTOR信号通路作为细胞内的一条重要的转导途径，在细胞的生长、存活、增殖、凋亡等过程中发挥着重要的生物学作用。硒是动物体必需的微量元素，在动物体的免疫防御过程中也发挥着重要的调控作用[9-10]。临床研究表明，饲料中添加适量的硒，能显著降低奶牛乳腺炎的发病率或减轻乳腺的病变程度。那么硒能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤，有待于进一步研究。【前人研究进展】一些研究者研究表明，在饲料中补充适量的硒后，不仅动物硒的营养状况得到改善，而且各种类型的乳腺炎发病率也明显降低[11-13]。如Aribi等研究发现，在饲料中添加硒后，患乳腺炎奶牛的体内嗜中性粒细胞的迁移速率显著增高，被感染乳区内巨噬细胞的数量也明显增加[14]。Hemingway 等研究发现，在日粮中添加硒后，奶牛乳汁内的体细胞数显著减少[15]。上述研究结果表明：奶牛日粮中硒的缺乏将增加乳腺被微生物感染的几率。而在饲料中添加硒可增强乳腺组织内免疫细胞的活性和数量，从而对病原微生物起到抑制作用。然而最近研究表明，硒也可抑制炎症相关信号通路的激活而抑制炎性介质的释放而起到抗炎的效果[16]。硒对信号通路的调控为乳腺炎的预防和治疗提供了新的方向。NF-κB和MAPK作为两条经典的炎症信号通路，在TLR2和Nod2等上游通路的介导下可诱发机体的炎症反应，并产生相应的免疫效应，如炎症细胞因子的释放和免疫细胞的分化。补硒能极显著地抑制巨噬细胞NF-κB和MAPK信号通路的激活，降低炎症细胞因子的表达[17-18]。如Zhang等研究发现，TNF-α的表达可反馈性的诱导NF-κB的活化，同时负反馈抑制硒蛋白的表达[19]。硒也可通过对NF-κB信号通路的调控抑制炎症细胞因子的基因表达，加速细胞的氧化还原反应，进而表现出抗炎作用[20]。硒也可通过对MAPK信号通路的调控抑制炎症细胞因子的基因表达，加速细胞的氧化还原反应，进而表现出抗炎作用[21]。【本研究切入点】硒虽然可以通过调节TLR2信号通路而减轻bMECs炎症反应[11]，但硒是否可通过调控Nod2/MAPK/mTORs信号通路而抑制诱导的bMECs炎症反应，有必要进行深入的研究。【拟解决的关键问题】本研究利用感染预孵育硒的bMECs后，检测bMECs Nod2/MAPK/ mTORs信号通路中相关基因表达水平变化情况，从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2016年9月至2018 年8月在临沂大学农林科学学院进行。

1.1 试验材料

（ATCC29213），扬州大学兽医学院外科教研室惠赠；BCA蛋白测定试剂盒，购自美国BioChain公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜，购自德国MiLople公司；Nod2、RIP2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin一抗购自美国Cell Signaling Technology公司（使用浓度1﹕2 000）；HRP标记羊抗兔IgG 购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 bMECs的分离和培养与试验分组

根据本课题组已经建立的原代奶牛乳腺上皮细胞培养方法[19]，采用机械剪碎配合 II 型胶原酶消化法培养原代奶牛乳腺上皮细胞。本试验共分3大组，即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组，即Low组（bMECs+2 μmol·L-1Se+）、Mid组（bMECs+4 μmol·L-1Se+）和Hig组（bMECs+8 μmol·L-1Se+），每组设3个重复。

1.3 S. aureus感染bMECs模型的建立

将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中，当细胞超过80%的汇合度时，用不同浓度硒（2，4和8 μmol·L-1）的培养基替换原来的培养基，继续培养12 h。然后用PBS洗涤每孔3次，将按MOI=1:1的比例加入6孔板中，继续培养0.5 h，然后收集bMECs细胞。

1.4 Western blotting检测相关关键因子蛋白的表达

根据试剂盒说明书的步骤，利用BCA蛋白测定试剂盒从上述被感染的bMECs中提取总蛋白。然后将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，上样量为20 μg/孔，之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h，脱脂乳脱脂后用TBST清洗后，分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜，回收一抗；之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗，室温孵育2 h，回收二抗；PVDF用TBST洗涤5次，最后在暗室条件下进行化学显影。

1.5 数据分析

用SPSS13.0软件进行数据分析，结果以Mean±SEM的形式表示。取＜0.05为显著性差异，＜0.01为极显著性差异。采用Graph pad prism 6.0软件绘图。

2 结果

2.1 硒对S. aureus诱导的bMECs中Nod2信号通路Nod2和RIP2 蛋白表达的影响

用2、4和8 μmol·L-1浓度的硒对bMECs进行预孵育，然后再进行感染处理，在感染后0.5 h，bMECs被收集并提取总蛋白。利用Western blotting法检测了Nod2和RIP2蛋白表达水平。结果显示，感染0.5 h后，Nod2蛋白水平显著升高（＜0.01）。在培养基里添加2 μmol·L-1的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（＜0.01），在培养基里添加8 μmol·L-1的硒可显著抑制Nod2的表达（＜0.05, 图1-A）。

结果显示，感染0.5 h后，RIP2蛋白水平显著升高（＜0.05），而在培养基里添加8 μmol·L-1硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（＜0.05, 图1-B）。

上述结果表明：硒能调控Nod2和RIP2 蛋白表达而抑制诱导的bMECs炎症反应。

2.2 硒对S. aureus诱导的bMECs中MAPK信号通路JNK 蛋白磷酸化水平的影响

用2、4和8 μmol·L-1浓度的硒对bMECs进行预孵育，然后再进行感染处理，在感染后0.5 h，bMECs细胞被收集并提取总蛋白。利用Western blotting法检测了JNK 蛋白的磷酸化水平。结果显示，与对照组相比，感染0.5 h后，模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（＜0.01）。在培养基里添加4 μmol·L-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（＜0.05），在培养基里添加8 μmol·L-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（＜0.01）（图2）。结果表明：硒能调控JNK 蛋白表达而抑制诱导的bMECs炎症反应。

2.3 硒对S. aureus诱导的bMECs中mTOR信号通路AKT和mTOR 蛋白磷酸化水平的影响

用2、4和8 μmol·L-1浓度的硒对bMECs进行预孵育，然后再进行感染处理，在感染后0.5 h，bMECs细胞被收集并提取总蛋白。利用Western blotting法检测了AKT和mTOR 蛋白磷酸化水平。如图3-A所示，与对照组相比，感染0.5 h后，模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（＜0.01）。在培养基里添加4 μmol·L-1硒可极显著抑制>JNK蛋白的磷酸化水平（＜0.01），在培养基里添加8 μmol·L-1硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（＜0.05）（图3-A）。

图2 硒对S. aureus诱导的bMECs中MAPK信号通路JNK 磷酸化水平的影响

A：AKT蛋白磷酸化水平；B：mTOR蛋白磷酸化水平

结果显示，感染0.5 h后，模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（＜0.01）。在培养基里分别添加4和8 μmol·L-1的硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（＜0.05,图3-B）。

上述结果表明：硒能调控AKT和mTOR 蛋白表达而抑制诱导的bMECs炎症反应。

3 讨论

可侵入到宿主细胞内部从而逃避胞外模式识别受体的攻击，而在这个过程中Nod2信号通路发挥了重要的作用[22-23]。目前，Nod2信号通路与炎症的关系也有了一定的研究进展，其中活化的Nod2蛋白主要通过CARD-CARD结构域之间的相互作用与RIP2分子结合，并以RIP2作为衔接蛋白进一步诱导后续炎症反应[24]。适当的炎症对机体是有益的，但是过度的炎症则会对组织器官造成伤害[25]。在本研究中发现在感染0.5 h后，Nod2和RIP2蛋白表达增加，此结果说明Nod2信号通路在早期感染中起重要作用。Western blotting结果证实，2 μmol·L-1和8 μmol·L-1的硒对Nod2蛋白的表达有一定的抑制作用，而8 μmol·L-1的硒对RIP2蛋白的表达有一定的抑制作用。上述结果说明硒能通过抑制Nod2信号通路的激活。

Nod2信号通路可进一步激活MAPK和mTORs等通路进一步诱导后续的炎症进程[26]。MAPK可分为ERK、P38和JNK 3个亚群[27]。在之前的研究中，我们发现硒对p38和ERK的磷酸化具有一定的调控作用[21]。而硒对JNK磷酸化的调控作用我们尚未涉及。因此，本研究利用Western blotting技术进一步探究了硒对JNK磷酸化水平的影响。结果表明，可显著提高 JNK蛋白磷酸化水平，4 μmol·L-1和8 μmol·L-1硒能降低诱导的JNK磷酸化表达。该结果也进一步说明硒可有效调控MAPK信号通路。

AKT是MAPK和mTORs信号通路之间的主要衔接蛋白[28-29]。伴随着MAPK信号通路的激活AKT也将随之活化将炎症信号向下游继续传导。本研究采用Western blotting技术检测了感染bMECs过程中AKT磷酸化水平的变化。结果表明，感染0.5 h后，AKT蛋白磷酸化水平显著增加，4和 8 μmol·L-1可有效降低AKT蛋白磷酸化表达水平。mTOR是AKT的重要底物。AKT可直接磷酸化mTOR的SER位点，激活mTORs信号通路[30]。本研究发现感染bMECs 0.5 h后，mTOR蛋白磷酸化水平增加，而硒同样可抑制mTOR蛋白的磷酸化表达。上述结果说明，硒对Nod2/RIP2/JNK/mTOR这条通路具有有效的调控作用。

4 结论

在奶牛乳腺炎过程中，可激活bMECs Nod2/MAPK/mTOR信号通路，而硒可通过调控Nod2、RIP2、JNK和mTOR等蛋白的表达而调控Nod2/ MAPK/mTOR信号通路。

[1] 李广栋, 吕东颖, 田秀芝, 姬鹏云, 郭江鹏, 路永强, 刘国世. 组学技术在奶牛乳房炎上应用的相关研究进展. 中国农业科学, 2019, 52(2): 350-358.

LI G D，LÜ D Y, TIAN X Z, JI P Y, GUO J P, LU Y Q, LIU G S. Research progress of omics technologies in cow mastitis., 2019, 52(2): 350-358.(in Chinese)

[2] 赫娜, 王长法, 杨宏军, 何洪彬, 杨少华, 王立群, 高运东, 仲跻峰. 牛源金黄色葡萄球菌突变株的筛选、鉴定及其免疫原性的研究. 中国农业科学, 2010, 43(10):2174-2181.

HE N, WANG C F, YANG H J, HE H B, YANG S H, WANG L Q, GAO Y D, ZHONG J F. Screening an attenuated strain and immunogenicity in mice of a bovine mastitis staphylococcus aureus mutant., 2010, 43(10):2174-2181. (in Chinese)

[3] 倪春霞, 蒲万霞, 胡永浩, 邓海平. 奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究. 中国农业科学, 2011, 44(2):417-422.

NI C X, PU W X, HU Y H, DENG H P. Research on coagulase genotyping of staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis., 2011, 44(2):417-422. (in Chinese)

[4] XIE X H, WANG L L, GONG F Y, XIA C, CHEN J, SONG Y, SHEN A X, SONG J X. Intracellular Staphylococcus aureus-induced NF-κB activation and proinflammatory responses of P815 cells are mediated by NOD2., 2012, 32(3): 317-323.

[5] FU Y H, ZHOU E S, LIU Z C, LI F Y, LIANG D J, LIU B. Staphylococcus aureus and Escherichia coli elicit different innate immune responses from bovine mammary epithelial cells., 2013, 155(4): 245-252.

[6] PRIE J C, BROMFIELD J J, SHELDON I M. Pathogen-associated molecular patterns initiate inflammation and perturb the endocrine function of bovine granulosa cells from ovarian dominant follicles via TLR2 and TLR4 pathways., 2013, 154(9): 3377-3386.

[7] HENG W, CHONGLIANG B, YINJIE W, JUN S, XIA M, JIANJI L. Selenium ameliorates Staphylococcus aureus-induced inflammation in bovine mammary epithelial cells by inhibiting activation of TLR2, NF-κB and MAPK signaling pathways., 2018, 14(1):197-205.

[8] ZHONG Y , NAITO Y , COPE L. Functional p38 MAPK identified by biomarker profiling of Pancreatic Cancer Restrains Growth through JNK Inhibition and Correlates with Improved survival., 2014, 20(23):6200-6211.

[9] 张振彪. 硒通过microRNA 155调控金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生的作用机制研究[D]. 武汉：华中农业大学, 2017.

ZHANG Z B. The mechanism of selenium onmastitis via microrna-155 regulating[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2017. (in Chinese)

[10] KIELISZEK M, STANISŁAW B. Current knowledge on the importance of selenium in food for living organisms: A review., 2016, 21(5): 609.

[11] SALMAN S, KHOL-PARISINI A, SCHAFFT H, LAHRSSEN M, HULAN H W, DINSE D. The role of dietary selenium in bovine mammary gland health and immune function., 2009, 10(1): 21-34.

[12] SORDILIO L M. Selenium-dependent regulation of oxidative stress and immunity in periparturient dairy cattle., 2013, 10: 1155-1540.

[13] BOURNE N, WATHES D C, LAWRENCE K E, MCGOWAN M, LAVEN R A. The effect of parenteral supplementation of vitamin E with selenium on the health and productivity of dairy cattle in the UK., 2008, 177(3): 381-387.

[14] ARIBI M, MEZIANE W, HABI S, BOULATIKA Y, MARCHANDIN H, AYMERIC J L. Macrophage bactericidal activities against Staphylococcus aureus are enhancedby selenium supplementation in a dose-dependent manner., 2015, 10: e0135515.

[15] HEMINGWAY R G. The influences of dietary selenium and vitamin E intakes on milk somatic cell counts and mastitis in cows., 1999, 23(8): 481-499.

[16] DUNTAS L H. Selenium and inflammation: Underlying anti- inflammatory mechanisms., 2009, 41: 443-447.

[17] ZAMAMIRI-DAVIS F, LU Y, ThOMPSON J T. Nuclear factor-κB mediates over-expression of cyclooxygenase-2 during activation of RAW 264.7 macrophages in selenium deficiency., 2002, 32(9): 890-897.

[18] JÓZSEF L, FILEP J G. Selenium-containing compounds attenuate peroxymitrite-mediated NF-κB and AP-1 activation and IL-8 gene and protein expression in human leukocytes., 2003, 35(9): 1018-1027.

[19] ZHANG F, YU W, HARGROVE J L, GREENSPAN P, DEAN R G, TAYLOR E W. Inhibition of TNF-α induced ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin expression by selenium., 2002, 161(2): 381-386.

[20] WANG H, BI C L, WANG Y J, SUN J, MENG X, LI J J. Selenium ameliorates Staphylococcus aureus -induced inflammation in bovine mammary epithelial cells by inhibiting activation of TLR2, NF-κB and MAPK signaling pathways., 2018, 14(1): 197.

[21] BI C L, WANG H, WANG Y J, DONG J S, MENG X, LI J J. Selenium inhibits Staphylococcus aureus-induced inflammation by suppressing the activation of the NF-κB and MAPK signaling pathways in RAW264.7 macrophages., 2016(780): 159-165.

[22] 徐丹丹, 杨彬, 孙志鹏, 武瑞. NOD1/NOD2介导的信号通路在小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎中的作用. 中国预防兽医学报, 2015, 37(7): 528-531.

XU D D, YANG B, SUN Z P, WU R. Effect of NOD1/ NOD2 mediated signal pathway ininduced mouse mastitis., 2015, 37(7): 528-531. (in Chinese)

[23] STROBER W, MURRAY P J, KITANI A, Watanabe T. Signalling pathways and molecular interactions of NOD1 and NOD2., 2006, 6(1): 9.

[24] FRIDH V, RITTINGER K. The Tandem CARDs of NOD2: Intramolecular Interactions and Recognition of RIP2., 2012, 7(3): e34375.

[25] 李琳. NLRC5对巨噬细胞炎性因子分泌的负性调控作用及机制研究[D]. 合肥：安徽医科大学, 2014.

LI L. Regulatory role and mechanisms of NLRC5in the cytokine secretion of macrophages[D] Hefei: Anhui Medical University, 2014. (in Chinese)

[26] KAMINSKA B. MAPK signalling pathways as molecular targets for anti-inflammatory therapy--from molecular mechanisms to therapeutic benefits., 2005, 1754(1): 253-262.

[27] ZHENG H Y, SHEN F J, TONG Y Q, LI Y. PP2A inhibits cervical cancer cell migration by ephosphorylation of p-JNK, p-p38 and the p-ERK/MAPK signaling pathway., 2018, 38(1): 115-123.

[28] FELDMAN M E, SHOKAT K M. New Inhibitors of the PI3K-Akt- mTOR Pathway: Insights into mTOR Signaling from a New Generation of Tor Kinase Domain Inhibitors (TORKinibs)., 2010, 347(1): 241.

[29] HUANG J X, MANNING B. A complex interplay between Akt, TSC2 and the two mTOR complexes., 2009, 37(1): 217.

[30] WEICHHART T, COSTANTINO G, POGLITSCH M, ROSNER M, ZEYDA M, STUHLMEIER K M. The TSC-mTOR signaling pathway regulates the innate inflammatory response., 2008, 29(4): 577.

Effects of Selenium on the Key Factors in Nod2/MAPK/mTORs Signaling Pathways in the bMECs Infected

BI ChongLiang1, LIU JunJun2, WANG Heng2,3, WANG Juan1, HAN ZhaoQing1, GUAN LiZeng1

(1College of Agriculture and Forestry Science, Linyi University, Linyi 276005, Shandong;2College of Medicine and Veterinary, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu;3Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009 Jiangsu)

【】Whether selenium (Se) could regulate the inflammatory damage of bovine mammary epithelial cells (bMECs) induced bythrough Nod2/MAPK/mTOR pathway remains to be further studied. So in the study, the effects of Se on the key proteins in the Nod2/MAPK/mTORs signaling pathway in the bovine mammary epithelial cells (bMECs) infected bywas studied in order to provide a theoretical basis for elucidating the immune regulation mechanism of Se.【】 Firstly, the bMECs were inoculated into the 6 well plates with 106cells/well. When more than 80% of the cells were confluent, the medium was replaced with the one containing different concentrations of Se (2, 4 and 8 μmol·L-1) and continued to culture for 12 h. Then after washing each well for 3 times with PBS,was added into 6-well plates at a ratio of MOI=1:1 and continued to culture for 0.5 h. The bMECs were collected for further detection of related proteins expression. The experiment was divided into three groups: control (Con) group (bMECs), model (Mod) group (bMECs+) and experimental group. The experimental group was divided into three sub-dose groups, namely Low group (bMECs+2 μmol·L-1Se+), Mid group (bMECs+4 μmol·L-1Se+) and Hig group (bMECs+8 μmol·L-1Se+), with three replicates each group. Total protein was extracted from the above bMECs using a bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit. The expressions level of Nod2 and RIP2 and the phosphorylation level of JNK, AKT and mTOR proteins in bMECs were detected by Western blotting. The protein samples were loaded into 10% SDS polyacrylamide gel for electrophoresis, and the uniform volume of protein was 20 μg/hole. Then the protein was transferred to polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes. The PVDF membranes were blocked with 5 mL 5% nonfat milk for 2 h, then skimmed the nonfat milk and washed the membranes with TBST, subsequently the membranes were incubated overnight with 5 mL primary antibodies including Nod2, RIP2, JNK, AKT, mTOR and β-actin. The primary antibodies were recovered, and 5 mL second antibodies were added to the membranes and incubated for 2 h at room temperature. Subsequently the second antibodies were recovered the membranes were washed with TBST for 5 times. Finally the membranes were developed with chemiluminescent substrate under darkroom conditions.【】could significantly increase the expression of Nod2 and RIP2 proteins and the phosphorylation of JNK, AKT and mTOR proteins in bMECs (＜0.01). At 0.5 h afterinfection, the level of Nod2 protein increased significantly (＜0.01). The expression of Nod2 protein was significantly inhibited by adding 2 μmol·L-1Se to the medium (＜0.01), and the expression of Nod2 was significantly inhibited by adding 8 μmol·L-1Se to the medium (＜0.05); at 0.5 h afterinfection, RIP2 protein level was significantly increased (＜0.05), while the expression of RIP2 protein was significantly inhibited by adding 8 μmol·L-1Se to the medium (＜0.05); at 0.5 h afterinfection, the phosphorylation level of JNK protein in model group was significantly higher than that in control group (＜0.01). The phosphorylation of JNK protein was significantly inhibited by adding 4 μmol·L-1Se to the medium (＜0.05), and the phosphorylation of JNK protein was significantly inhibited by adding 8 μmol·L-1Se to the medium (＜0.01); at 0.5 h afterinfection, the phosphorylation level of AKT protein in the model group was significantly higher than that in the control group (＜0.01). The phosphorylation level of JNK protein was significantly inhibited by adding 4 μmol·L-1Se to the medium (＜0.01). The phosphorylation level of AKT protein was significantly inhibited by adding 8 μmol·L-1Se to the medium (＜0.05). After 0.5 h ofinfection, the phosphorylation level of mTOR protein was significantly increased in the model group (＜0.01). The phosphorylation of mTOR protein was significantly inhibited by adding 4 and 8 μmol·L-1Se to the medium (＜0.05). 【】Se could alleviate the inflammatory response of bMECs induced byby inhibiting the protein expression of key factors in the bMECs Nod2/MAPK/mTORs signaling pathway.

selenium;; Nod2/MAPK/mTORs; bMECs

2018-12-06；

2019-03-26

国家自然科学基金青年基金（31802254）、山东省高等学校科技计划项目（J18KB074）

毕崇亮，Tel：15589035156；E-mail：lydxbcl@163.com。

关立增，Tel：15216519159；E-mail：guanlizeng@163.com

（责任编辑 林鉴非）