趋化因子γ干扰素诱导蛋白-10和巨噬细胞炎性蛋白-3a在肝癌患者外周血中的表达及诊断价值

刘娜 张长庚 李伟 孙巨勇

衡水市人民医院检验科（河北衡水 053000）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是 我国常见的恶性肿瘤之一。近年来外科手术、介入栓塞及靶向治疗等治疗手段在肝癌治疗中取得良好的临床效果[1]。但肝癌患者缺乏特异性的症状和体征，发现时多已是中晚期，失去手术治疗机会。甲胎蛋白（AFP）是目前诊断HCC的主要血清学指标，但其敏感性不理想，约有1/3早期肝癌AFP阴性，因此有必要深入研究肝癌的发生发展的分子机制，寻找早期诊断肝癌的血清肿瘤标志物[2]。

巨噬细胞炎性蛋白-3a（macrophage inflammatory protein-3 alpha，MIP-3a），也称CCL20，表达于巨噬细胞，淋巴细胞，树突状细胞等多种细胞，对T淋巴细胞、单核细胞等细胞均有趋化作用，体外细胞实验中发现具有促进肿瘤细胞增殖和迁移的作用[3]。γ干扰素诱导蛋白-10（interferon-inducible protein-10，IP-10）又称CXCL10，与配体CXCR3相互作用，参与调节肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成及肿瘤免疫等。目前MIP-3a、IP-10在肝癌患者血清中的表达及其临床意义的研究报道较少。本研究将通过分析MIP-3a及IP-10在肝癌患者血清中的表达，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集自2017年10月至2018年10月间于我院诊治的118例乙肝相关肝细胞癌患者作为HCC组。其中男78例，女40例；年龄39～72岁，平均年龄（45.1±6.5）岁。肿瘤大小：＜3 cm者69例，≥3 cm者49例。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期65例、Ⅲ～Ⅳ期53例。肿瘤分化：高分化22例，中分化63例，低分化33例。纳入标准：（1）所有HCC患者均符合2015年版《原发性肝癌规范化病理诊断指南》诊断标准[4]。（2）患者慢性乙型肝炎诊断符合2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[5]。（3）所有患者均为首次诊治，未接受过其它治疗。（4）除外乙肝病毒阴性的HCC及甲型肝炎、丙肝肝炎患者。排除标准：（1）合并急性细菌性感染、HIV感染及结核杆菌感染。（2）梅毒密螺旋体抗体阳性。（3）合并自身免疫性疾病。

100例乙肝肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者作为LC组，该组男67例，女33例，年龄35～78岁，平均年龄（42.1±6.1）岁。100例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者作为CHB组，该组男71例，女29例，年龄34～74岁，平均年龄（44.0± 7.3）岁。

100例健康体检人员作为健康对照组，该组男69例，女31例，年龄33～72岁，平均年龄（41.0±6.8）岁。各组性别、年龄之间差异无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经我院伦理委员会审核通过，所有患者及家属均知情同意并已签署知情同意书。

1.2 研究方法HCC组、LC组、CHB组于复诊时或入院后、对照组健康体检者于当天清晨采集空腹12 h静脉血3 mL置于EDTA抗凝管中，室温下静置2 h，2 000 r/min离心10 min，血清分离后吸取上层血清置于EP管中保存，保存在-80℃冰箱中待测。通过液相芯片技术（Luminex）对各组对象外周血趋化因子MIP-3a、IP-10水平测定。仪器为Bio-Plex 200（美国Bio-Rad公司），趋化因子MIP-3a、IP-10磁珠检测试剂盒由美国Bio-Rad公司生产。实验步骤严格按照相关说明书操作。血清病毒学指标及血清AFP检测采用电化学发光法检测，检测仪器为Cobase601电化学发光免疫分析仪，乙肝病毒标志物试剂盒及AFP试剂盒购自Roche公司。AFP临界值为20 ng/mL，AFP＞20 ng/mL为阳性。

1.3 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件处理数据，计量资料以±s表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验，多组数据均数比较采用行单因素方差分析，组间差异差异比较采用Dunnet检验。计数资料用率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清趋化因子IP-10和MIP-3a的表达比较HCC组、LC组、CHB组患者血清MIP-3a平均含量分别为（40.14±8.75）、（18.01±4.53）、（14.43± 3.56），（3.22 ± 1.15）pg/mL，HCC组血清MIP-3a含量显著高于LC组、CHB组及健康对照组（P＜0.05），LC组、CHB组显著高于健康对照组（P＜0.05），而LC组与CHB组之间差异无统计学意义（P=0.647）。

HCC组、LC组、CHB组及健康对照组血清IP-10平均含量分别为（132.23±18.54）、（68.01±15.73）、（64.62 ± 11.19）、（30.71 ± 7.15）pg/mL，HCC组血清IP-10显著高于LC组、CHB组及健康对照组（P＜0.05），而LC组、CHB组显著高于健康对照组（P＜0.05），而LC组与CHB组之间差异无统计学意义（P=0.501）。见图1。

图1 HCC组、LC组、CHB组及健康对照组血清IP-10及MIP-3a水平比较Fig.1 Comparison of serum IP-10 and MIP-3a levels in HCC group，LC group，CHB group and healthy control group

2.2 HCC组患者血清IP-10和MIP-3a的表达与临床病理特征之间的关系HCC组患者血清IP-10和MIP-3a的表达水平与肿瘤TNM分期、肿瘤分化以及有无远处转移之间差异有统计学意义（均P＜0.05），而在性别、年龄、肿瘤大小及血清AFP水平之间差异无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 ROC曲线分析血清趋化因子IP-10、MIP-3a及AFP对肝癌的诊断价值血清趋化因子IP-10、MIP-3a及AFP的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.832、0.734、0.772，而 IP-10、MIP-3a联合诊断的AUC为0.920，见表2、图2。IP-10、MIP-3a的诊断准确性中等（0.7＜AUC ≤ 0.9），IP-10、MIP-3a联合诊断的诊断准确性较高（0.9＜AUC＜1），联合诊断的敏感性和特异性均高于任一单一指标。

表1 HCC患者血清IP-10、MIP-3a表达水平与临床病理特征的关系Tab.1 The relationship between the expression level of serum IP-10 and MIP-3a and clinicopathological features in patients with HCC ± s，pg/mL

表1 HCC患者血清IP-10、MIP-3a表达水平与临床病理特征的关系Tab.1 The relationship between the expression level of serum IP-10 and MIP-3a and clinicopathological features in patients with HCC ± s，pg/mL

参数性别例数IP-10t值0.656 P值0.513 MIP-3a t值1.547 P值0.125男女78 40 133.64±19.64 131.23±17.38 39.54±7.60 41.91±8.40年龄（岁）＜60≥60肿瘤大小（cm）＜3≥3肿瘤分化高中分化低分化TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ远处转移65 53 69 49 85 33 65 53 131.23±18.87 135.23±18.36 130.23±17.08 136.23±18.47 122.37±15.66 158.91±21.64 109.13±16.50 162.91±19.34 1.159 1.818 10.172 16.298 6.670 0.249 0.072 0.000 0.000 0.000 39.25±8.70 41.14±9.02 39.05±7.32 41.61±8.75 37.14±5.47 50.14±10.08 37.30±8.62 48.14±8.10 1.155 1.725 8.991 6.980 9.078 0.251 0.087 0.000 0.000 0.000有无19 99 159.64±19.77 126.23±20.02 57.26±9.37 37.14±8.75 AFP（ng/mL）＜400≥400 1.5600.1211.8510.067 73 45 137.08±20.75 131.23±18.09 39.41±8.33 42.44±9.12

表2 血清趋化因子IP-10、MIP-3a、AFP及IP-10与MIP-3a联合诊断的诊断价值Tab.2 Diagnostic value of combined diagnosis of serum chemokines IP-10，MIP-3a，AFP，IP-10 and MIP-3a

3 讨论

研究表明，肿瘤微环境中产生的某些趋化因子如CXCL12及其配体CXCR4、CXCL8及其配体CXCR1等，能促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、远处转移及血管生成等恶性生物学过程[6]。

MIP-3a可招募表达其配体CCR6的树突状细胞、淋巴细胞等，免疫细胞活化后提呈抗原，通过免疫反应发挥抗肿瘤免疫效应[7]。本研究中，HCC组血清MIP-3a含量显著高于LC组、CHB组及健康对照组，其机制可能是肝癌细胞的抑癌基因TP53突变热点R249S和V157F发生突变，肿瘤细胞获得干细胞样基因表达特征，促进肿瘤侵袭和转移[8]。此外，本研究进一步分析HCC组患者血清MIP-3a的表达与临床病理特征间的关系，结果表明HCC组患者MIP-3a与肿瘤TNM分期、肿瘤分化及是否存在远处转移有关，分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化及伴有远处转移的患者的血清MIP-3a分别明显高于分期Ⅰ～Ⅱ、高中分化及不伴有远处转移的患者。有研究表明MIP-3a可通过PI3K/PKB和Wnt/β-catenin通路途径诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转变（EMT），结果促进HCC细胞增殖和迁移[9]。此外，HCC细胞来源的MIP-3a能诱导单核细胞来源的巨噬细胞表达吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO），通过在肿瘤微环境中抑制自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞的功能，发挥促进HCC进展的作用[10]。因此，HCC进展受到肿瘤微环境中HCC产生的MIP-3a的影响，肿瘤分期越高，分化越差，肿瘤细胞中MIP-3a表达水平增高越明显。与此同时，肝癌细胞分泌产生的MIP-3a增加，进而导致患者血清中MIP-3a水平升高。

图2 血清IP-10、MIP-3a、两者联合诊断及AFP的ROC曲线Fig.2 Serum IP-10，MIP-3a，combined diagnosis and ROC curve of AFP

IP-10通过与G蛋白偶联趋化因子受体CXCR3结合并激活下游信号传导，影响淋巴细胞的募集和定向迁徙，介导炎症、适应性免疫、肿瘤细胞转移和血管生成等过程[11]。有研究表明，HCC肿瘤微环境中趋化因子IP-10及其配体表达增加，其表达水平与血清AFP水平和TNM分期有关，CXCL10表达水平较高的患者总生存率和无病生存率显着低于CXCL10表达水平较低的患者[12]。本研究发现HCC组血清IP-10显著高于LC组、CHB组及健康对照组。HCC组患者血清IP-10的表达与肿瘤TNM分期、肿瘤分化及是否存在远处转移有关，其原因可能是CXCL10能促使肿瘤细胞上调表达基质金属肽酶-2（MMP-2），并使肿瘤细胞发生上皮间质转化，进而促进HCC细胞的迁移、侵袭和转移过程，当在体外细胞实验和动物体内实验中，敲低IP-10表达或MMP-2的表达明显抑制HCC细胞转移[13]。本研究进一步探讨血清趋化因子IP-10、MIP-3a对肝癌的诊断价值，结果表明IP-10、MIP-3a联合诊断的诊断准确性较高，联合诊断的敏感性和特异性均高于任一单一指标，因而两者有可能成为临床诊断的新的分子标志物。

综上所述，HCC患者血清趋化因子IP-10、MIP-3a表达上调，并且两项指标的表达水平与TNM分期、病理分级及是否存在远处转移有关，可能在HCC发生发展的过程中发挥重要作用。联合检测血清趋化因子IP-10、MIP-3a有希望成为HCC新的诊断、治疗及随访的肿瘤标志物。