胃癌中NPR-A、P38MAPK及细胞骨架Tubulin-a的表达及意义

2019-08-26张卢舜李育庄李春辉

实用医学杂志 2019年16期

张卢舜李育庄李春辉

承德医学院附属医院病理科（河北承德 067000）

胃癌是常见的恶性肿瘤[1]，近年来胃癌发病率呈上升趋势，胃癌常需靶向治疗[2-3]，因此，研究胃癌的发病机制及寻找胃癌治疗新的药物作用靶点显得尤为重要。心房钠尿肽受体A（natriuretic peptide receptor-A，NPR-A）在肺癌、前列腺癌等中均有表达[4-6]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的异常能促进肿瘤细胞的增殖且能增强细胞迁移及血管生成。细胞骨架微管蛋白a（Tubulin-a）作为细胞骨架的重要组成部分与肿瘤的浸润和转移有密切关系。有关胃癌中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a的表达及临床意义的研究目前尚未见报道，本研究用免疫组化、Western blotting及QRT-PCR检测胃癌中NPRA、P38MAPK、Tubulin-a的蛋白和mRNA表达，并分析其与临床病理特征间的关系及相关性，为研究胃癌的发病机制提供新的思路，为胃癌的靶向治疗提供潜在的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料2016年9月至2017年9月承德医学院附属医院手术治疗的胃癌患者标本41例，术中均留取胃癌组织和正常胃黏膜组织（距肿瘤边缘10 cm以上），所有患者术前均未接受放化疗，术后均由病理确诊为胃腺癌，其中男27例，女14例，年龄38～85岁，高中分化17例、低分化24例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期19例、Ⅲ～Ⅳ期22例，有淋巴结转移20例、无淋巴结转移21例，浆膜浸润34例、无浆膜浸润7例（本研究经伦理委员会通过）。

1.2 蛋白检测

1.2.1 免疫组化方法采用SP法测定NPR-A、P38MAPK和Tubulin-a在标本中的表达，具体步骤均按试剂盒说明书进行。以PBS代替一抗做阴性对照。采用双盲法判定，两名实验人员单独阅片，根据细胞染色强度评分和阳性细胞所占百分比评分的乘积来判定蛋白表达情况。

1.2.2 Westernblotting法取约0.1 g新鲜组织，按试剂盒说明得到蛋白上清液，以BCA法测定蛋白浓度，进行10%sSDS-Page凝胶电泳，加入一抗、二抗后，用ECL发光法显影，得到图像运用Image J分析得到灰度值，以目的蛋白灰度值除以内参灰度值得到目的蛋白相对表达量。

1.3 基因检测运用QRT-PCR法检测。按照试剂盒说明，进行RNA提取并测其浓度，然后依据试剂盒说明进行QRT-PCR扩增。各指标引物序列均经TAKARA公司设计。实验结果以2-ΔΔCt来表示目的基因的相对表达量。

1.4 统计学方法运用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计数资料比较采用χ2检验和连续性校正的χ2检验。计量资料以（±s）表示，比较采用两组间t检验。相关性分析采用Spearman相关分析法。以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a蛋白和mRNA在胃癌组织和正常胃黏膜组织表达比较免疫组化显示NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a阳性表达为弥漫分布于胞质和胞膜的棕黄色颗粒，染色颗粒粗大。胃癌组织组化切片中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a阳性表达率分别为26.8%（11/41）、46.3%（19/41）、85.4%（35/41），正常胃黏膜组织阳性表达率分别为56.1%（23/41）、24.4%（10/41）、65.9%（27/41）（P＜ 0.01，P=0.03，P=0.04）；蛋白印记法中胃癌组织蛋白相对表达量分别为（1.20±0.43）、（2.20±0.43）、（2.07±0.55），正常胃黏膜组织中为（1.90±0.68）、（1.35 ± 0.50）、（1.49 ± 0.48）（均P＜ 0.01）。胃癌组织中NPR-A蛋白相对表达量低于正常胃黏膜组织，胃癌组织中P38MAPK、Tubulin-a蛋白表达量高于正常胃黏膜组织（均P＜0.05，图1～4）。

胃癌组织中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a mRNA相对于正常胃黏膜组织的表达量分别为（0.14±0.05）、（3.23 ± 1.25）、（2.07 ± 0.55），胃癌组织中NPR-A的mRNA相对表达量低于正常胃黏膜组织，胃癌组织中P38MAPK、Tubulin-a的mRNA相对表达量表达量高于正常胃黏膜组织（均P＜0.05，图5）。

图1 NPR-A在胃癌和正常黏膜组织中的表达Fig.1 The expression of NPR-A in gastric carcinoma and normal gastricmucosa

图2 P38MAPK在胃癌和正常黏膜组织中的表达Fig.2 The expression of P38MAPK in gastric carcinoma and normal gastricmucosa

图3 Tubulin-a在胃癌和正常黏膜组织中的表达Fig.3 The expression of cytoskeleton Tubulin-a in gastric carcinoma and normal gastricmucosa

图4 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a在胃癌组织和正常黏膜组织中的表达Fig.4 The expression of NPR-A、P38MAPK and Cytoskeleton Tubulin-a protein in gastric carcinoma and normal gastric tissue

2.2 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a的蛋白和mRNA表达与胃癌临床病理参数之间的关系NPR-A蛋白的表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05）。P38MAPK蛋白的表达与胃癌淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05）。Tubulin-a蛋白的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05。表1）。NPR-A mRNA的表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05）。P38MAPK mRNA的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05）。Tubulin-a mRNA的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05，表2）。

图5 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a在胃癌组织和正常黏膜组织中mRNA的表达Fig.5 The expression of NPR-A、P38MAPK and Cytoskeleton Tubulin-a mRNA in gastric carcinoma and normal gastric tissue

2.3 胃癌组织中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a蛋白和mRNA表达的相关性NPR-A与P38MAPK、Tubulin-a蛋白在胃癌组织中的表达均呈负相关（r=-0.441，P＜ 0.01；r=-0.354，P＜ 0.01）。NPR-A与P38MAPK、Tubulin-a mRNA在胃癌组织中的表达均呈负相关（r=-0.581，P＜ 0.01；r=-0.579，P＜ 0.01）。

3 讨论

NPR-A为心房钠尿肽（ANP）的主要受体，其通过与ANP结合，从而影响细胞增殖、凋亡[7]。本研究发现胃癌组织中NPR-A蛋白表达量低于正常胃黏膜组织，且随着分化程度降低、浸润程度加深、淋巴结转移及TNM分期变高而下降，NPR-A mRNA表达情况与蛋白一致，说明随着胃癌的发生、发展NPR-A表达下调，NPR-A可能起着抑制胃

癌发生发展的作用，这就为NPR-A可能成为靶向治疗的潜在靶点提供了理论依据，也有学者研究发现NPR-A在不同类型的癌中NPR-A的表达不同[8]，其具体机制有待于进一步研究。

表1 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a蛋白表达与胃癌临床病理参数的关系Tab.1 The relationship between the expressions of NPRA，P38MAPK and Tubulin-a protein and the clinical pathological features in gastric carcinoma by WB ±s

临床病理参数年龄≤60岁＞60岁性别例数NPR-A P值P38MAPK P值Tubulin-a P值17 14 1.23±0.44 1.15±0.430.612.25±0.37 2.13±0.500.452.20±0.09 1.90±0.190.14男女分化程度高、中分化低分化淋巴结转移无有22 9 13 18 10 21 1.27±0.48 1.03±0.22 1.47±0.48 0.99±0.24 1.52±0.55 1.03±0.24 0.18＜0.01＜0.01 2.25±0.49 2.07±0.19 2.30±0.49 2.18±0.32 2.65±0.29 2.03±0.27 0.30 0.43＜0.01 2.03±0.59 2.18±0.44 1.84±0.64 2.23±0.43 1.67±0.61 2.26±0.41 0.50 0.07＜0.01 TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期浸润深度＜浆膜层≥浆膜层12 19 1.48±0.51 1.00±0.24＜0.012.56±0.35 2.02±0.28＜0.011.80±0.63 2.24±0.430.03 4 27 2.04±0.26 1.06±0.28＜0.012.66±0.66 2.17±0.370.021.45±0.47 2.16±0.510.01

表2 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a mRNA表达与胃癌临床病理参数的关系Tab.2 The relationship between the expressions of NPRA、P38MAPK and Tubulin-a mRNA and the clinical pathological features in gastric carcinoma ±s

临床病理参数年龄≤60岁＞60岁性别例数NPR-A P值P38MAPK P值Tubulin-a P值15 16 0.15±0.05 0.14±0.050.572.78±1.28 3.64±1.150.061.67±0.64 2.07±0.500.07男女分化程度高、中分化低分化淋巴结转移无有21 10 13 18 13 18 0.15±0.05 0.13±0.06 0.18±0.05 0.12±0.04 0.18±0.05 0.12±0.04 0.43 0.01＜0.01 3.31±1.19 3.09±1.42 2.73±0.96 3.59±1.35 2.15±0.94 3.75±1.22 0.65 0.06＜0.01 1.83±0.56 1.97±0.69 1.71±0.47 1.99±0.66 1.52±0.42 2.14±0.58 0.55 0.20＜0.01 TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期浸润深度＜浆膜层≥浆膜层15 16 0.17±0.05 0.12±0.04＜0.012.33±0.99 4.07±0.84＜0.011.46±0.41 2.26±0.47＜0.01 8 23 0.19±0.05 0.12±0.04＜0.012.05±0.88 3.64±1.11＜0.011.48±0.37 2.01±0.610.03

近年来研究显示，P38MAPK在乳腺癌、前列腺癌等呈过度表达，表明其可能与肿瘤发生、发展有关[9]，本研究结果显示胃癌组织中P38MAPK蛋白和mRNA表达量高于正常胃黏膜组织，说明P38MAPK可能促进了胃癌的发生发展，但其蛋白随着浸润程度加深、淋巴结转移及TNM分期变高而下降，而mRNA却上升，推测P38MAPK mRNA随着胃癌恶性程度加深而增加，磷酸化的P38MAPK才是其活性形式，细胞外信号磷酸化激活P38MAPK通路后从而促进胃癌的侵袭和转移。

已有研究[10]表明Tubulin-a在肺癌等中呈过度表达；王天阳等[11]运用洛铂通过破坏胆管癌RBE细胞Tubulin骨架、抑制Tubulin-amRNA的表达，将细胞周期阻滞在G2/M期，导致生长抑制；LV等[12]用牛奶树碱抑制微管蛋白Tubulin-a聚合从而诱导胃癌细胞的自噬。本实验显示胃癌组织中Tubulin-a蛋白表达量高于正常胃组织，说明Tubulin-a很可能促进了肿瘤的增殖。本实验还得出Tubulin-a蛋白和mRNA随着浸润程度加深、淋巴结转移及TNM分期变高而增加，提示微管蛋白Tubulin-a与胃癌的侵袭、转移有密切的联系，结合文献[13-14]推测Tubulin-a异常表达与胃癌的侵袭、转移有关。

有研究[15]显示有效增加ANP的量来抑制RASMEK1/2-ERK1/2信号通路治疗多发性骨髓瘤，说明ANP和NPR-A结合可能通过阻碍细胞周期和抑制RAS-MEK1/2-ERK1/2信号通路影响相关蛋白表达来发挥抗肿瘤作用，Tubulin-a参与细胞周期活动是细胞周期中不可或缺的参与者，而P38MAPK和ERK通路共同参与调节了肿瘤细胞的增殖等[15]，本研究结果显示NPR-A与P38MAPK、Tubulin-a蛋白及mRNA在胃癌组织中的表达均呈负相关，由此得出NPR-A与P38MAPK、Tubulin-a对胃癌的发生、发展中起到拮抗作用，其作用机制可能是NPR-A可通过调控信号传导通路P38MAPK影响细胞骨架Tubulin-a的改变进而抑制胃癌的侵袭和转移，本研究前期也发现胃黏膜组织NPR-A高表达时，与高浓度ANP结合显著下降KCNQ1蛋白的表达，延迟整流钾离子通道亚基Kv1.3等的表达水平降低，抑制P38MAPK和Tubulin-a的表达，从而抑制胃癌的发生发展，侵袭和侵袭。

总之，笔者对NPR-A与P38MAPK、Tubulin-a蛋白及mRNA在胃癌组织中的关系研究为胃癌发病机制的研究提供了新的思路，为NPR-A成为胃癌治疗潜在的药物作用靶点提供了依据。