长链非编码RNA RP11-356I2.2对胃癌的调控作用研究

2019-08-26李歆冯金鑫杨素冰刘高杰张相良

实用医学杂志 2019年16期

李歆冯金鑫杨素冰刘高杰张相良

广州医科大学附属肿瘤医院1检验科，2腹外科（广州510095）

胃癌在我国所有恶性肿瘤的发病率和死亡率中名列第二位[1]。其预后差，临床仍需探索出新的早期诊断方法、预后指标以及寻找有效治疗靶点[2]。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）通过多种机制（如基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mRNA降解和翻译调控等）在多种层面上（如表观遗传学、转录调控及转录后调控等）调控基因的表达水平[3]，与蛋白质、RNA和DNA相互作用。越来越多的研究证实，LncRNA在肿瘤中异常的表达水平与肿瘤的发生发展关系密切，可作为双重调控因子参与肿瘤发生发展的多种过程[4-5]。笔者在前期研究中，通过应用高通量LncRNA表达谱芯片及定量RT-PCR发现RP11-356I2.2在胃癌病人血清中异常表达，且经精准腹腔热灌注化疗后RP11-356I2.2上调明显[6]，但是RP11-356I2.2对胃癌细胞的增殖、迁移及成瘤的调控机制目前尚未完全阐明。本研究通过实验检测胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901细胞中RP11-356I2.2的表达变化，并过表达RP11-356I2.2对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移能力的影响，将转染了过表达RP11-356I2.2质粒的胃癌细胞SGC-7901/RP11-356I2.2注入裸鼠皮下观察SGC-7901/RP11-356I2.2细胞成瘤能力的改变。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂正常人胃黏膜细胞株GES-1以及人胃癌细胞株SGC-7901、BGC-823均来自广州医科大学附属肿瘤医院细胞库。各细胞系均用含10%FBS的DMEM培养基培养，置于37℃、5%CO2的恒温孵箱中常规进行传代培养。DMEM培养液由美国Gibco公司生产，实时荧光定量PCR试剂盒购自于日本Takara公司，RP11-356I2.2质粒由上海吉玛公司提供，Lipofectamin2000、TRIzol购于美国Invitrogen公司。结晶紫染液、MTT试剂盒等购自美国Sigma公司，细胞培养皿、Transwell小室、离心管等一次性耗材购自美国BD公司。

1.2 胃癌细胞的RP11-356I2.2表达水平检测实验采用Real-Time PCR法检测胃黏膜GES-1细胞和胃癌BGC-823、SGC-7901细胞中的RP11-356I2.2表达水平的差异。首先，应用Trizol法提取组织和细胞中的总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，用TakaraSYBR Premix Ex Taq试剂盒检测样品中RP11-356I2.2及内参GAPDH的相对表达量，具体操作步骤按说明书进行。RP11-356I2.2上游引物序列为：5′-TGCCCATGTCCACCCATAAG-3′，下游引物序列为：5′-TCGGGGACTGGCATTTTCAC-3′；内参 GAPDH上游引物序列为：5′-CCATGAGAAGTATGACAAC-3′，下游引物序列为：5′-GAGTCCTTCCACGATACC-3′，以 2-ΔΔCt法表示 RP11-356I2.2 相对表达量。

1.3 RP11-356I2.2对胃癌细胞增殖、迁移的调节作用观察

1.3.1 分组将胃癌SGC-7901细胞分为RP11-356I2.2过表达组、空质粒组，分别转染SGC-7901过表达质粒、空质粒，转染试剂均应用Lipofectamin2000试剂，实验步骤均按其说明书进行操作，转染后37℃恒温培养24 h。

1.3.2 各组胃癌细胞增殖能力观察MTT法：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL，铺板使待测细胞调密度至103～104个/孔，5%CO2、37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，细胞贴壁后即可加药。每组6个复孔，每孔加入20 μL的MTT反应液，合并加入150 μL二甲基亚砜，为充分溶解结晶物，将体系置于水平摇床上以最低速振荡12 min。在酶标仪波长490 nm条件下测得各孔的OD490。

克隆形成实验：取对数生长期的细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，离心，将转染后各组细胞以每孔500～800个细胞的密度接种于6孔板中，放入孵箱，调整细胞密度到103/mL，每3～4 d更换培基，连续培养2～3周，培养结束后以纯甲醇固定30 min，再以0.1%结晶紫染液染色20～30 min，最后以清水漂洗干净，倒置晾干后取照，将培养板置于显微镜下计数克隆数。

1.3.3 各组胃癌细胞迁移能力观察Transwell小室实验：先让细胞撤血清饥饿12～24 h，去除血清的影响。应用胰酶消化细胞，含血清培养基终止消化，1 000 r/min离心弃去培养基，用PBS洗涤1至2遍，用无血清培养基重悬细胞。利用计数仪调整细胞密度至105～106个/mL。取细胞悬液100～200 μL加入Transwell小室。将小室置入预先添加有500 μL含FBS的培养基，37℃恒温培养 24 h。无菌棉签轻柔拭去小室内表面细胞，纯甲醇固定滤膜20～30 min。固定结束，以0.1%结晶紫染色25 min，显微镜下统计穿膜细胞总数。

细胞划痕实验：转染后24 h，在各组细胞培养孔内用10 μL Tip头划3～5条均匀的平行线，定期更换含1%FBS的培养基，连续定期监测48 h，测算划痕愈合率。

1.4 RP11-356I2.2构建及成瘤观察

1.4.1 RP11-356I2.2构建（1）胃癌细胞株SGC7901在无菌条件下培养至状态良好；（2）转染前，取对数期细胞用胰酶消化，并接种六孔板中培养；（3）A液：无血清培养基稀释RP11-356I2.2过表达质粒及空质粒；B液：无血清培养基稀释Lipofecta-

min2000转染剂；（4）A液、B液室温下各自孵育5 min后，将A液和B液混匀并孵育15 min，即配置成含有RP11-356I2.2过表达及空质粒转染剂；（5）当细胞密度达50%时，用六孔板PBS漂洗2～3遍，更换无血清培养基，同时分别加入含有RP11-356I2.2过表达的转染剂及空质粒转染剂，轻摇后置入培养箱；（6）6 h后将含有Lipofectamin2000的培养基洗去，更换新培基；（7）转染72 h后，行效果监测及相关实验。

1.4.2 RP11-356I2.2成瘤观察取20只约5周龄的雌性裸鼠，并随机均等分为RP11-356I2.2对照组及过表达组，每组10只裸鼠，分别在其背部皮下注射转染处理后24 h的RP11-356I2.2过表达组细胞和空质粒组细胞约1.5×106个，3周后处死小鼠，并测量肿瘤体积和质量。计算体积（V）公式：V=（L×W2）/2，其中 L是肿瘤的最大径线长度，W是肿瘤的最大宽度。

1.5 统计学方法统计应用GraphPad Prism 6和SPSS 20.0软件。数据以（±s）表示，组间应用方差分析以及独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BGC-823、SGC-7901、GES-1细胞中RP11-356I2.2相对表达量比较 BGC-823、SGC-7901细胞中RP11-356I2.2的相对表达水平分别是GES-1的（0.45±0.22）、（0.37±0.25）倍，相对表达水平均显著低于GES-1细胞（P＜0.05）。

2.2 各组胃癌细胞增殖能力比较各组别胃癌SGC-7901/RP11-356I2.2的细胞OD490以及克隆形成总数见表1，RP11-356I2.2过表达组的OD490值、克隆形成数均低于空质粒组（P＜0.05）。

表1 各组胃癌BGC-823、SGC-7901细胞OD490值和克隆形成数比较Tab.1 Comparison of OD490value and cloning number of BGC-823 and SGC-7901 cells in each group ±s

注：与siRNA对照序列组相比，*P＜0.05；与空质粒组相比，#P＜0.05

组别RP11-356I2.2siRNA组siRNA对照序列组RP11-356I2.2过表达组空质粒组OD490 BGC-823细胞0.86±0.08*1.22±0.05 0.69±0.06#1.44±0.03 SGC-7901细胞1.39±0.25*1.89±0.10 1.13±0.04#1.74±0.06克隆数（个）BGC-823细胞109.76±9.50*302.51±11.74 83.20±21.33#141.00±11.51 SGC-7901细胞124.67±12.79*284.33±13.50 71.78±23.54#118.02±14.98

2.3 各组胃癌细胞迁移能力比较RP11-356I2.2过表达组SGC-7901细胞穿膜细胞数低于空质粒组[（241.16 ± 7.95）vs.（433.41 ± 13.71），P＜ 0.01，图1-2]。RP11-356I2.2/SGC-7901及空质粒/SGC-7901细胞划痕愈合率分别为（17.67±1.53）% 、（62.67±2.52）%，差异统计学意义（P＜0.05，图3）。

2.4 RP11-356I2.2过表达组、对照组裸鼠肿瘤体积及质量的比较SGC-7901/RP11-356I2.2组裸鼠肿瘤体积、小于对照组裸鼠肿瘤体积分别为[（322.61± 161.53）mm3vs.（718.30 ± 246.43）mm3，P=0.017]，见图4A、B；SGC-7901/RP11-356I2.2组裸鼠肿瘤质量亦小于对照组[（0.42± 0.22）mgvs.（0.88±0.36）mg，P=0.041]，见图4C）。

3 讨论

胃癌在我国的发病率和死亡率近几年均居高不下，并有缓慢上升的趋势[7]，临床上缺乏有效的早期筛选生物标记物，胃癌患者的总体预后较差，若出现远处转移，5年生存率低于10%。

图1 Transwell小室实验（显微镜下观察迁移至下室细胞，200×）Fig.1 TranswellChamber experiment（microscopically，the cells migrated to the lower ventricle with a magnification of 200×）

图2 Transwell实验（任意选择9个高倍镜视野，统计侵袭迁移至下室细胞数目）Fig.2 Transwell experiment（Select 9 high power microscopic fields randomly and count the number of invasive cells migrating to the lower ventricle）

图3 划痕实验检测过表达RP11-356I2.2对胃癌细胞迁移能力的影响Fig.3 Scratch assay was used to detect the effect of overexpression of RP11-356I2.2 on migration of gastric cancer cells

图4 裸鼠动物模型Fig.4 Nude mice model

既往诸多研究揭示，LncRNA几乎全程参与胃癌的发生发展。其中包含肿瘤细胞的侵袭转移、增殖凋亡、自噬、多药耐药及预后等多个过程[8-11]。例如，有学者证实LncRNA DGCR5在胃癌组织和胃癌患者血浆样本中下调，其下调与晚期TNM分期及淋巴转移阳性有关，DGCR5过表达可以抑制肿瘤生长，抑制miR-23b和增殖抗原Ki-67的表达，同时调控PTEN和BTG1在体内的表达[12]。JIN等[13]研究表明，Lnc00165在胃癌组织和细胞系中表达上调，Lnc00165的高表达与胃癌的肿瘤结节浸润深度、转移分期和总生存期存有密切关系。功能实验表明，Lnc00165基因的下调抑制了GC细胞的增殖、迁移和侵袭，Lnc00165基因的过表达刺激了GC细胞的增殖、迁移和侵袭；在机制上，Lnc00165可促进GC细胞的上皮间质转化。ZHANG等[14]研究表明LncRNA HOXC-AS3在体外和体内均可调节细胞增殖和迁移，RNA下拉质谱分析发现YBX1与HOXC-AS3相互作用，RNA-seq分析发现YBX1敲除后差异表达的基因与HOXC-AS3转录调控的基因明显重叠，说明YBX1参与了HOXC-AS3介导的基因转录调控在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用。在胃癌细胞系中LncRNA H19可通过H19/miR-675/FADD/caspase 8/caspase 3通路调节胃癌细胞的生长[15]。此外，LIU 等[16]研究表明，RUNX1的引入抑制了H19/miR-675诱导的Akt/mTOR通路激活，以及随后AGS细胞的增殖和侵袭，RUNX1作为H19/miR-675轴与Akt/mTOR信号通路之间的链接，是H19/miR-675诱导胃癌进展的关键中介因子。

LncRNA水平的异常表达与多种人类疾病包括癌症有关，可通过DNA或组蛋白甲基化、染色质重塑，从而改变基因的表达。还具有吸附miRNA的海绵功能[17-18]。LncRNA在调控组织分化的重要机制已取得大量研究成果，其在胃癌及结直肠癌中的作用也逐渐被揭晓。目前仍存在争议的是，其在肿瘤中究竟发挥促进亦或抑制的作用[19-20]。本研究发现胃癌细胞中RP11-356I2.2显著低于正常胃黏膜上皮细胞的表达水平，这与笔者前期研究中利用GEO数据库进行胃癌相关基因分析得出的RP11-356I2.2是胃癌相关抑癌基因的结论一致。采用胃癌SGC-7901细胞系过表达RP11-356I2.2，能显著抑制胃癌细胞的增殖和侵袭迁移能力。裸鼠成瘤实验进一步验证，注入稳定表达SGC-7901/RP11-356I2.2细胞系后，裸鼠体内裸鼠成瘤能力显著减弱。其证实RP11-356I2.2在调控胃癌细胞增殖、侵袭迁移、成瘤能力等各方面均具有重要作用，初步阐明RP11-356I2.2在胃癌发生发展过程中的作用机制。以上研究结果提示，RP11-356I2.2参与胃癌的发生发展过程，可作为胃癌早期诊断和评判胃癌预后的重要潜在分子标志物。但是，其调控下游基因转录和蛋白质翻译的作用，通过何种信号转导通路发挥此作用，以及介导上游因子的调控机制，都有待更进一步的研究。