利用SSR技术对小麦田间混杂株的初步鉴别

王妍卿 ，裴忠有 ，陈玉春，任丽丽

（1.天津市中农大棉花抗性遗传研究中心，天津 300308；2.天津农学院，天津 300384；3.天津市种子管理站，天津 300061；4.天津中天大地科技有限公司，天津 300384）

小麦是中国重要的粮食作物之一，属自花授粉作物，但在生产过程中经常发现有异杂株混入情况，严重影响小麦品种的品质和产量。因此，为更好地鉴定小麦品种的种子纯度，需要一种操作简单、准确率高的鉴定小麦品种纯度的检测方法。近年来，SSR（Simple Sequence Repeat）标记技术作为常用的分子检测技术，具有多态性水平高、检测到的信息量大、操作方便、结果易于分析统计等优点，越来越受到广泛重视及应用。目前，该技术已广泛应用于小麦、大麦、玉米等农作物的杂种纯度鉴定、遗传图谱构建、基因定位与克隆等研究。

本研究利用SSR标记技术鉴别济麦22与其他2种疑似混杂植株小麦是否为同一品种。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料选用济麦22（CK）及田间疑似混杂品种（S1、S2），由天津市中天大地科技有限公司提供。

根据相关文献，选择30对从小麦EST中设计的SSR引物，由苏州金唯智生物科技有限公司合成提供。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦基因组DNA的提取 济麦22及2种疑似混杂株样品，每个样品分别选取10个单株小麦叶片，采用CTAB法提取小麦基因组DNA，并通过α-DNA（10 ng·μl-1）对基因组DNA进行粗略定量。

1.2.2 PCR扩增 以小麦基因组DNA为模板，用30对SSR引物（表1）进行PCR扩增，扩增程序为 95℃ 预变性5 min，94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸15 s，扩增 35个循环，72℃延伸10 min，4℃温度条件下保存备用。

表1 引物列表

1.2.3 SSR特异性引物的筛选 PCR扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行初步筛选，选择扩增带型稳定、多态性丰富、重复性好的引物作为SSR 引物用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试验。

1.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 利用上述SSR筛选引物对济麦22、混杂株S1、S2进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试验，试验所涉及的药品试剂及具体方法参见参考文献[8]。

2 结果与分析

2.1 小麦基因组DNA的提取和检测

本试验采用CTAB法提取小麦基因组DNA，结果表明DNA条带清晰，完整性较好（图1）。虽然没有使用RNase对基因组DNA中的RNA进行消化，但不影响SSR分析。

将DNA样品使用α-DNA（10 ng·μl-1）进行粗定量，将DNA浓度调整为10 ng·μl-1。

2.2 SSR引物筛选

利用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行引物初筛。选择扩增条带清晰、多态性丰富的引物作为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的筛选引物。通过图2从30对SSR引物中筛选出10对引物（标红泳道）用于SSR变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试验。

2.3 SSR变性聚丙烯酰胺检测

利用17-F/R、18-F/R、19-F/R、20-F/R、23-F/R、24-F/R、26-F/R、27-F/R、29-F/R、30-F/R共10对SSR引物，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对济麦22及混杂株进行筛选。

图3显示，通过不同引物对CK、S1、S2的扩增，均能表现出 S2扩增带型与CK结果一致，而S1出现差异条带。说明混杂株S2与济麦22为同一品种，混杂株S1与济麦22不是同一品种。

3 结论

试验表明，通过SSR标记变性聚丙烯酰胺电泳技术可以将目标品种济麦22与两种疑似田间混杂株进行品种鉴别。结果表明，混杂株S2与济麦22是同一品种，在田间表型上S2株高普遍较济麦22高2～3 cm，其他表型无差异，推测可能与田间肥水管理、保护行设置有关，而混杂株S1在田间表型上株高较济麦22高度4 cm左右，且叶片宽度较大，芒较多，与济麦22表型存在较大差异，因此，S1与济麦22不是同一品种。