HPLC 法同时测定良姜胃疡胶囊中7 种成分

2019-08-26肖耀华雷丹丹徐国波廖尚高

中成药 2019年8期

肖耀华，雷丹丹，徐国波，周孟，何迅，廖尚高*

（1. 贵州医科大学药学院，贵州贵安新区550025； 2. 国家苗药工程技术中心，民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州贵阳550004）

良姜胃疡胶囊是临床用于治疗寒凝气滞所致胃脘疼痛、反酸嘈杂、胃十二指肠溃疡症状的中药复方制剂, 收载于国家药品监督管理局《国家中成药标准汇编》（中成药地方标准上升国家标准部分）内科脾胃分册中[1], 由铁筷子、吴茱萸、地乌泡、高良姜、藿香5 味中药材加工而成, 方中铁筷子具有祛风止痛、理气解毒的功效, 主治胃痛和腹痛[2-4]；吴茱萸具有镇痛、抗炎、抗菌、抗胃溃疡等作用, 为常用的温中散寒药[5-7]。

目前, 良姜胃疡胶囊中除地乌泡药材以外的其他4 味中药材已有较多质量控制报道[8-11], 但其现有标准中仅对吴茱萸碱、吴茱萸次碱进行TLC 定性鉴别和含有量测定, 显得较为单薄。因此, 本实验通过HPLC 法同时测定良姜胃疡胶囊中东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含有量, 为全面评价该制剂质量提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters2998 型PDA 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； SG8200HE 型超声波提取器（上海冠特超声仪器有限公司）； TB-2150D 型电子天平（十万分之一, 北京赛多利斯仪器系统有限公司）； ZYCGF-Ⅱ-10T 型超纯水机（四川卓越水处理设备有限公司）。

1.2 试药东莨菪苷（批号D0401AS）、异嗪皮啶（批号J0709AS）、东莨菪内酯（批号S0305AS）对照品均购自大连美仑生物技术有限公司；吴茱萸碱（批号 920C022）、吴茱萸次碱（批号831A022）、吴茱萸新碱（批号327A021）对照品均购自北京索莱宝科技有限公司；去氢吴茱萸碱（批号P24M7F11741）对照品购自上海源叶生物科技有限公司。良姜胃疡胶囊（贵州宏奇药业有限公司, 0.5 g×12 粒/板×2 板/盒, 批号20180501、20180601、 20180602）。甲醇为色谱纯（美国天地有限公司）；甲酸为分析纯（重庆茂业化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（150 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相甲醇（A） -0.1% 甲酸（B）, 梯度洗脱（0 ～8 min, 10% ～21% A； 8 ～14 min, 21%A； 14 ～20 min, 21% ～29% A； 20 ～29 min, 29%A； 29 ～35 min, 29% ～55% A； 35 ～42 min, 55% ～73% A； 42 ～60 min, 73% ～100%A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长267 nm （吴茱萸碱）、 334 nm （东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱）；进样量10 μL。在此色谱条件下, 各成分分离度＞1.5, 见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 对照品溶液制备精密称取对照品东莨菪苷12.91 mg、去氢吴茱萸碱8.04 mg、东莨菪内酯6.51 mg、异嗪皮啶9.99 mg、吴茱萸碱5.75 mg、吴茱萸次碱6.90 mg、吴茱萸新碱5.00 mg, 甲醇配制成0.516 4、 0.225 1、 0.130 2、 0.239 8、0.109 3、 0.179 4、 0.050 0 mg/mL, 摇匀, 即得,4 ℃冰箱中保存备用。

2.3 供试品溶液制备称取同一批胶囊内容物0.5 g, 置于平底烧瓶中, 精密加入70% 甲醇25 mL, 称定质量, 回流提取30 min, 冷却至室温, 70%甲醇补足减失质量, 摇匀, 滤过, 即得。

2.4 阴性样品溶液制备按照胶囊处方比例及制备工艺, 分别制备缺吴茱萸、铁筷子的阴性样品,按“2.3” 项下方法制备, 即得。

2.5 线性关系考察精密量取“2.2” 项下对照品溶液, 70%甲醇稀释成5 个质量浓度, 各精密吸取10 μL, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X）, 峰面积为纵坐标（Y）进行回归, 结果见表1, 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度试验取同一批供试品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次, 测得东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱峰面积RSD 分别为 0.27%、 1.17%、 1.00%、 0.28%、 1.61%、1.03%、 1.13%, 表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验取同一批供试品溶液, 室温下于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 测得东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱峰面积RSD 分别为0.33%、 1.81%、 0.79%、0.57%、 0.23%、 0.25%、 0.59%, 表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验取同一批胶囊6 份, 按“2.3”项下方法制备供试品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 测得东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含有量 RSD 分别为 2.00%、 2.05%、2.19%、 1.71%、 2.34%、 1.49%、 2.59%, 表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验精密称取含有量已知的胶囊9 份, 每份约0.5 g, 按成分原有量加入50%、100%、 150%水平的对照品各3 份, 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 计算回收率。结果, 东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱平均加样回收率分别为102.21%、 102.34%、 102.63%、 101.73%、98.84%、 101.59%、 101.89%, RSD 分别为1.20%、2.00%、 0.95%、 0.69%、 1.05%、 0.87%、 1.37%。

2.10 样品含有量测定取3 批胶囊, 按“2.3”项下方法制备供试品溶液, 在“2.1” 项色谱条件下进样测定, 外标法计算含有量, 结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 讨论

3.1 检测波长考察本实验采用二极管阵列检测器, 对各成分在190～400 nm 波长处进行紫外吸收扫描, 发现东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱分别在226、 289、 339 nm, 248、 363 nm, 228、297、 343 nm, 333 nm, 225、 267 nm, 213、343 nm, 214、 238、 322、 334 nm 处有最大吸收峰。再考察不同检测波长下色谱峰数目、丰度、分离度, 发现东莨菪苷、去氢吴茱萸碱、东莨菪内酯、异嗪皮啶、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱, 以及吴茱萸碱分别在334、 267 nm 波长下基线平稳, 色谱丰度较好, 故选择两者作为检测波长。

3.2 洗脱条件考察本实验比较了甲醇-水[12]、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸[13-15]的分离效果,发现甲醇-0.1%甲酸洗脱时色谱峰峰形、分离度较理想, 故选择其作为流动相。

3.3 柱温考察本实验比较了25、 30、 35 ℃下的分离效果, 发现30 ℃时各成分分离度最理想, 故选择其作为柱温。

3.4 提取方法考察本实验比较了回流、超声提取对提取率的影响, 发现前者更优；比较了提取溶剂（水、 50%甲醇、 70%甲醇、甲醇）对提取率的影响, 发现70% 甲醇提取时色谱峰数量更多；比较了提取时间（30、 60、 90、 120 min）对提取率的影响, 发现提取30 min 时色谱峰数量与峰面积最理想, 提取60 min 时与30 min 时相当, 而提取120 min 时色谱峰数量反而减少, 故选择30 min作为提取时间。综上所述, 最佳提取方法为70% 甲醇回流提取30 min。