二甲双胍对银屑病样小鼠模型皮损炎症状态及磷酸化Stat3蛋白表达的影响

苏蓓蓓 甘泉 甘才斌

新乡市中心医院皮肤科，河南 453000

银屑病是由免疫、遗传及环境等多种因素介导的慢性炎症性皮肤病，具体发病机制不清［1］。信号转导和转录激活因子3（Stat3）是JAK/Stat信号转导途径中最为关键的核转录因子之一，在细胞增殖、凋亡、分化和血管生成、免疫调节及癌症等方面具有重要的生物学作用［2］。既往研究认为，JAK/Stat3信号转导可通过影响角质形成细胞增殖及凋亡、机体炎症因子的表达等在银屑病发病机制中具有关键性作用［3-4］。二甲双胍是一种临床上广泛应用于2 型糖尿病的降糖药，对皮肤科诸多疾病如银屑病、痤疮等也具有一定作用［5］。研究显示［6-7］，二甲双胍可通过下调JAK/Stat3信号转导抑制食管鳞状上皮和胰腺肿瘤细胞的生长。二甲双胍对于银屑病的潜在疗效是否可能通过减少Stat3磷酸化实现尚不清楚。我们通过构建咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损模型，观察二甲双胍对小鼠银屑病样皮损的严重程度、血清炎症因子及皮损组织中白细胞介素17（IL-17）和p-Stat3表达水平的影响。

材料与方法

一、材料

6 ～8周龄雄性健康SPF级Balb/c小鼠，体重17～24 g，产自河南新乡华兰生物实验动物中心［实验动物合格证号：201801140035，动物生产许可证号：SCXK（豫）2015-0001］，小鼠在室温 23 ℃ ±1 ℃、明/暗各12 h的条件下饲养，自由取食（高压蒸汽灭菌用水及正常饲料喂养），动物实验许可证号SCXK（豫）2017-002。二甲双胍粉剂（美国Sigma公司）纯度≥97%，用pH6.8 的磷酸盐缓冲液在超声振荡下溶解。咪喹莫特乳膏（规格：3 g∶0.15 g，湖北科益药业股份有限公司）。一抗为兔抗鼠IL-17及p-Stat3 单克隆抗体（英国Abcam 公司），二抗即辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG单克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司）。小鼠IL-17 和肿瘤坏死因子α（TNF-α）Quantikine ELISA 试剂盒（美国R&D 公司），鼠IL-6 Quantikine ELISA 试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）。

二、方法

1.动物分组和药物干预处理：将50只Balb/c雄性小鼠随机分为对照组、咪喹莫特组、3 个咪喹莫特联合二甲双胍组（IM-Met组中二甲双胍浓度分别为 100、150 和 200 g/L），每组 10 只。5 组小鼠体重差异无统计学意义（F=0.98，P＞ 0.05）。小鼠背部使用脱毛膏脱毛，对照组局部外用凡士林乳膏且腹腔注射生理氯化钠溶液0.3 ml，咪喹莫特组局部外用咪喹莫特［8］且腹腔注射生理氯化钠溶液0.3 ml，3 个IM-Met 组局部外用咪喹莫特，腹腔分别注射100、150 和 200 g/L 二甲双胍溶液 0.3 ml。于每天9：00 涂药和腹腔注射，以首次干预作为第1 天，连续7 d，每日记录小鼠银屑病样皮损的面积与严重度指数（PASI）积分，7 d 后处死所有小鼠。预实验结果表明，用二甲双胍干预IM-Met 组7 d后，对照组、咪喹莫特组和100、150、200 g/L IM-Met组小鼠随机血糖值分别为10.45、9.63、11.87、9.32、10.73 mmol/L，5 组间随机血糖值差异无统计学意义（F=1.28，P＞0.05）；晚8点小鼠禁食后于清晨7 点测5 组小鼠空腹血糖值分别为5.87、4.63、6.14、5.55、6.02 mmol/L，各组间差异无统计学意义（F=1.57，P＞0.05）。

2.Western 印迹检测皮损 IL-17 和 p-Stat3 的表达：取5 组小鼠背部皮肤置于研钵中，加入液氮并研磨成粉末后移入1.5 ml EP 管，加入500 μl RIPA裂解液（含苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂），冰上孵育约30 min，4 ℃下12 000 r/min（离心半径4 cm）离心20 min，吸取上清液于-80 ℃冰箱中保存。取5 μl 蛋白样品进行凝胶电泳，电转液中电转，牛奶封闭，加入一抗IL-17 抗体（1∶1 000）、p-Stat3 抗体（1∶1 000）、β 肌动蛋白抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，洗膜后分别加入二抗（1∶1 000）孵育1 h，采用化学发光法检测目的条带的灰度值，以目的蛋白与β 肌动蛋白灰度值比值表示蛋白表达水平。所有实验重复3次。

3.血清IL-17、IL-6和TNF-α水平测定：处死小鼠时取眶周血5 ml于抗凝管中，在常温下离心收集上层血清-80 ℃冰箱中保存。采用ELISA法检测小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α的表达水平，具体步骤参考试剂盒说明书。每只小鼠测定时均设置3 个复孔，取3次检测的平均值。

三、统计学处理

结 果

一、二甲双胍对小鼠银屑病样皮损形态学和组织学的影响

7 d后，对照组小鼠背部皮肤未出现明显变化，而咪喹莫特组小鼠背部出现大面积红斑和鳞屑。100、150 和 200 g/L IM-Met 组小鼠背部红斑面积和鳞屑相对于咪喹莫特组显著减轻，见图1。150 g/L IM-Met 组红斑和鳞屑严重程度显著低于100 g/L IM-Met组，但同200 g/L IM-Met组比较无明显区别。

图1 第7天肉眼观察5组小鼠背部皮肤状况 对照组小鼠背部皮肤光滑；咪喹莫特（IM）组小鼠背部出现红斑和大量厚层鳞屑；3个IM-二甲双胍（IM-Met）组小鼠背部均出现红斑和厚层鳞屑，但程度轻于IM组小鼠；150 g/L IM-Met组和200 g/L IM-Met组红斑面积和鳞屑厚度相近，但均少于100 g/L IM-Met组

图2 5组小鼠背部皮损的组织学改变（HE×100） 对照组小鼠背部皮肤表皮及真皮层结构无异常；咪喹莫特（IM）组表皮增厚，表皮突延长，伴有角化不全及微脓肿；3个IM-二甲双胍（Met）组表皮稍增厚，伴有角化不全及微脓肿

组织病理检查（HE染色）结果（图2）显示，与对照组比较，咪喹莫特组表皮明显增厚，表皮突延伸伴有角化不全及微脓肿；而IM-Met 组表皮增厚程度轻于咪喹莫特组；150 g/L IM-Met 组表皮增厚程度轻于100 g/L IM-Met组，但同200 g/L IM-Met组相比变化不明显。

二、二甲双胍对小鼠PASI积分的影响

5 组小鼠 PASI 积分第 1 ～ 7 天变化见图 3。第1 ～3天咪喹莫特组及IM-Met组4组小鼠间PASI积分无显著差异。第4 ～7 天，咪喹莫特组PASI 积分显著高于IM-Met 组小鼠，差异均有统计学意义（F值分别为 9.45、12.82、19.66 和 22.47，均P＜0.05）。第 4 天开始 100 g/L IM-Met 组 PASI 积分显著高于150 g/L IM-Met组和200 g/L IM-Met组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而150 g/L IM-Met组和200 g/L IM-Met 组第1 ～7 天差异均无统计学意义（t值分别为 1.34、0.98、1.10、1.18、0.35、0.33 和0.29，均P＞0.05）。

三、二甲双胍对小鼠银屑病样皮损中IL-17和p-Stat3蛋白表达水平的影响

图3 5组小鼠皮损银屑病皮损面积与严重度指数（PASI）积分变化 IM，咪喹莫特；Met，二甲双胍

见图4 和表1。Western 印迹检测显示，5 组小鼠背部皮损IL-17和p-Stat3蛋白表达水平差异有统计学意义（均P＜0.05）。咪喹莫特组IL-17和p-Stat3蛋白表达水平同对照组相比显著升高（均P＜0.01）；150 g/L200 g/L IM-Met 组 IL-17 和 p-Stat3 蛋白表达水平差异无统计学意义（均P＞0.05），但均低于100 g/L IM-Met 组（均P＜0.05）和咪喹莫特组小鼠（均P＜0.05）；100 g/L IM-Met组小鼠背部皮损区IL-17和p-Stat3蛋白表达同咪喹莫特组相比显著降低（均P＜0.05）。

四、二甲双胍对小鼠血清IL-17、IL-6 和TNF-α表达水平的影响

5组小鼠血清炎症因子IL-17、IL-6和TNF-α水平差异均有统计学意义（F值分别为15.69、36.78和20.41，均P＜0.05），对照组3 种炎症因子水平均显著低于其余4 组，而咪喹莫特组均显著高于其余4 组（均P＜0.05）。3 个IM-Met 组血清炎症因子表达水平两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），200、150 和 100 g/L IM-Met 组 IL-17、IL-6 和TNF-α水平依次升高。见表2。

讨 论

多项研究表明，JAK/Stat3 信号转导通路在银屑病发病机制中具有重要作用［3-4，9-10］。Sano 等［9］发现，K5.Stat3c转基因小鼠皮肤角质形成细胞中过度表达活化的Stat3，出生2周后小鼠皮肤开始出现斑块和鳞屑，组织病理和银屑病病理特点相一致，使用寡聚核苷酸抑制Stat3 蛋白表达可显著减少K5.Stat3c 小鼠银屑病样皮损形成。冉立伟等［10］通过免疫组化检测21例银屑病患者皮损和20例正常皮肤Stat3 和p-Stat3 表达水平，发现银屑病患者皮损Stat3 和 p-Stat3 表达水平显著升高，且与 PASI 呈正相关。

图4 5 组小鼠背部皮肤组织中白细胞介素17 和p-Stat3 蛋白的表达情况 1：对照组；2：咪喹莫特（IM）组；3：100 g/L IM-二甲双胍（Met）组；4：150 g/L IM-Met组；5：200 g/L IM-Met组

表1 银屑病样小鼠背部皮肤组织中白细胞介素17（IL-17）和p-Stat3蛋白相对表达水平

表2 银屑病样小鼠血清炎症因子水平比较（ng/L，）

表2 银屑病样小鼠血清炎症因子水平比较（ng/L，）

注：n=10。IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子α；IM：咪喹莫特；Met：二甲双胍。a 与对照组比较，P＜0.05；b 与咪喹莫特组比较，P＜0.05；c 与200 g/L IMMet组比较，P＜0.05；d 与150 g/L IM-Met组比较，P＜0.05

组别对照组咪喹莫特组IM-100 g/L Met组IM-150 g/L Met组IM-200 g/L Met组F值P值IL-17 15.882±1.793 49.567±5.697a 44.008±1.722a b c d 33.388±1.556a b c 26.720±2.156a b 15.69＜0.05 IL-6 96.294±3.195 281.014±12.881a 260.926±7.724a b c d 210.741±4.440a b c 174.997±9.501a b 36.78＜0.05 TNF-α 128.779±3.266 291.117±3.245a 271.409±3.037a b c d 249.434±8.594a b c 193.034±6.661a b 20.41＜0.05

二甲双胍作为一种常用的降糖药在临床上使用多年，但其对皮肤科疾病如银屑病也具有潜在的治疗效果。2008 年一项包含36 702 例初诊为银屑病患者的病例对照研究结果显示，口服二甲双胍能显著降低银屑病的发病风险［11］。Wu 等［12］调查9 243 例糖尿病患者发现，经常口服二甲双胍可显著降低银屑病的发生风险。Singh 和 Bhansali［13］对38例银屑病合并代谢综合征患者开展的一项单中心随机对照试验结果显示，试验组患者口服二甲双胍联合甲氨蝶呤后红斑、鳞屑及持续时间得分显著低于单独口服甲氨蝶呤患者。既往研究提示，二甲双胍治疗银屑病的可能机制包括：上调人角质形成细胞内腺苷酸活化蛋白激酶和p-ERK1/2 水平，通过抑制P38 丝裂原激活的蛋白激酶信号转导通路的激活或抑制mTOR 及其下游因子核糖体S6 蛋白激酶的蛋白表达来抑制人角质形成细胞的过度增殖［14-15］；抑制 Raf/EPK 信号转导通路从而降低人角质形成细胞Nrf2的表达［16］，而Nrf2属于调节角质形成细胞过度增殖的关键蛋白之一［17］。

本研究结果显示，3个IM-Met组小鼠背部皮肤红斑面积、鳞屑严重程度和PASI 积分、皮损中IL-17及p-Stat3蛋白表达水平和血清炎症因子水平均显著低于咪喹莫特组；200、150 g/L 二甲双胍溶液对于小鼠皮肤红斑面积和鳞屑严重程度的降低及PASI 积分的改变无显著差异，且这两组小鼠背部皮损区p-Stat3和IL-17蛋白水平也同样无显著差异，但均低于咪喹莫特组和100 g/L IM-Met组小鼠，提示二甲双胍对于银屑病的治疗作用可能是通过减少Stat3的活化，同时治疗作用呈非剂量依赖性。本实验结果与二甲双胍可减少Stat3活化的结论［6-7］相一致，但上述研究均未明确表明二甲双胍如何抑制JAK/Stat3 信号转导及具体的分子生物学相关机制。卢博等［18］采用不同浓度二甲双胍作用于多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226 和U266 发现，二甲双胍通过抑制Stat3 的磷酸化抑制RPMI8226和U266细胞的增殖并诱导其凋亡。我们对银屑病小鼠模型血清炎症因子的检测发现，二甲双胍浓度越高，小鼠血清炎症因子水平越低，可能因为二甲双胍干预后，血清炎症因子的变化相对于皮损区蛋白水平的变化更加敏感，也可能与二甲双胍本身可通过抑制蛋白激酶B 和细胞外信号调节激酶信号通路进而抑制NF-κB活化、降低机体炎症因子释放有关［19-20］，但这些推测需要更多的实验加以证实。

以上结果表明，二甲双胍显著降低银屑病小鼠模型机体的炎症状态可能是通过减少Stat3磷酸化所致。然而，本研究的局限性在于仅仅证明二甲双胍能够减少Stat3 的磷酸化，并未对调节Stat3 的上游信号如JAK或腺苷酸活化蛋白激酶等进行研究。尽管多项研究显示，二甲双胍能显著抑制角质形成细胞过度增殖［21-22］，但这些研究的局限性在于仅仅探讨了二甲双胍对人角质形成细胞的影响，而非银屑病患者或动物模型。我们首次探讨二甲双胍对银屑病样小鼠模型的作用及其相关机制，为该药应用于银屑病的治疗提供了一定的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

志谢新乡医学院动物中心所有参与本实验的老师、本科生及研究生