全二维气相色谱-飞行时间质谱法分析不同季节酿造的青稞酒挥发性组分特征

刘志鹏，车富红，李善文，冯声宝，陈双，徐岩*

1(江南大学 生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室 酿造微生物与应用酶学实验室，江苏 无锡，214122) 2(青海互助青稞酒股份有限公司，青海 海东，810500)

青稞酒是我国青海及西藏地区特产的一种清香型白酒，因其独特的地理环境、酿酒原料和“清蒸清烧四次清”生产工艺等特点，形成了有别于其他清香型白酒的独特风格[1]。青稞酒的风味研究始于20世纪90年代，彭秉顺等[2]分析了青稞酒与其他几种香型白酒的主要微量成分，认为乙酸乙酯和乳酸乙酯是青稞酒的主体香。2012年，许锦文等[3]报道了青稞酒中主要醇类和酯类物质的含量。2014年，高文俊等[4]使用气相色谱-嗅闻仪联用技术(gas chromatography-olfactometry, GC-O)和气相色谱-质谱联用(GC-mass spectrometry, GC-MS)在青稞酒中鉴定出66种香气化合物，通过定量分析和香气活力值分析(odor activity value，OAV)确定了27种重要的香气物质。但相比其他香型白酒，对青稞酒挥发性风味组分的研究相对较少，形成青稞酒特征香气的风味化学组成尚不清晰。白酒作为一种典型的多菌种自然发酵产品，生产环境是影响其风味的重要因素[5]。青稞酒主要酿造地在青藏高原地区，该地区属大陆寒温带气候，冬季最低气温为-20 ℃，夏季最高温度为20 ℃，季节差异明显。这种季节环境的变化导致不同季节酿造的青稞酒的风味具有明显差异，但是形成这种风格差异的风味物质目前尚不清楚。

白酒的香气由上千种不同的组分共同决定[5]，目前白酒中挥发性化合物的研究通常采用传统一维GC-MS[4,6-8]。然而一维GC由于分离能力有限无法完成复杂基质中大量挥发性组分的有效分离，常常需要结合多种样品前处理方法和预分离手段[9]。全二维气相色谱技术(comprehensive two-dimensional gas chromatography, GC×GC)通过2种极性不同的气相色谱柱实行正交分离，相比一维气相色谱具备高峰容量、高灵敏度和有序色谱的优点，能够为解析白酒等复杂样品中的组分提供有效分离能力[10-12]。通过全二维气相色谱分离结合飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometry, TOFMS)检测，在白酒中能够分离检测到上千个色谱峰[13-16]。大量色谱峰的检出，对化合物的鉴定是一个巨大的挑战。GC×GC-TOFMS分析的结果往往首先通过仪器自带的软件结合化合物数据库进行自动的质谱比对鉴定，给出初步的鉴定结果，如徐平等[12]通过GC×GC- TOFMS分析软件在泸州老窖中鉴定出1 000多种组分。但由于白酒组分的复杂性，软件自动处理给出的仅是可能的鉴定结果，鉴定误差往往较大，因此还需要进一步验证分析。ZHU等[11]通过GC×GC-TOFMS分析软件的数据处理结合同系物出峰规律在茅台酒中鉴定出528种挥发性组分。陈双等[14]采用多级鉴定策略在芝麻香白酒中确认了可信度较高的340种挥发性化合物。为提高全二维鉴定结果的可靠性，保留指数比对和标准品比对等方法已逐步用于复杂样品中化合物的鉴定分析。WELDEGERGIS等[17]和KUPSKA等[18]通过比对质谱和保留指数在葡萄酒中初步鉴定出上百种挥发性组分，并对其中部分化合物进行标准品验证，该方法对大量色谱峰鉴定来讲是一种有效策略。但白酒中二维色谱化合物鉴定还未见采用保留指数比对和标准品比对的报道。

本研究采用顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)结合GC×GC-TOFMS解析了青稞酒挥发性组分，通过对鉴定方法的优化确定了青稞酒中挥发性组分的特征，进一步比较了不同季节酿造的青稞酒挥发性组分的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

本研究采用的样品为青海互助青稞酒股份有限公司提供的二楂青稞酒原酒(2017—2018年)，分别在春夏秋冬4个季节(4、7、11和2月)入窖。从每个季节酿造的4个窖池中的酒样各取100 mL并混合，作为代表酒样，酒精度为59.5%～65.5% vol。

1.1.2 试剂

用于定性的标准品均为色谱纯，购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)， TCI America (Portland, OR, USA)。C7-C30直链正构烷烃和乙醇(色谱级)， Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。NaCl(化学纯)，中国医药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备

纯水仪，Millipore公司；顶空固相微萃取多功能自动进样系统(MPS2)，德国Gerstel公司； 50/30 μm三相萃取头DVB/CAR/PDMS，美国Supelco公司；全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(GC×GC-TOFMS, Pegasus®4D)，美国LECO公司； 7890B气相色谱仪、一维色谱柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国安捷伦公司；二维色谱柱Rxi-17Sil MS(1.5 m×0.25 mm×0.25μm)，美国Restek公司。

1.2 试验方法

1.2.1 顶空固相微萃取(HS-SPME)试验方法

试验方法参照本实验室前期优化建立的方法进行[4]。将2 mL白酒样品和8 mL超纯水及3 g NaCl置于20 mL顶空瓶中，并添加10 μL内标(正己醇-d13，终质量浓度为402 μg/L)，由MPS2进行HS-SPME操作。样品在50 ℃下平衡5 min，萃取45 min，转速设置为400 r/min。萃取完成后挥发性化合物和半挥发化合物于GC进样口，在250 ℃下解吸附5 min，10∶1分流，进行GC×GC-TOFMS分析。相同条件下每个样品各进样3次。

1.2.2 GC×GC-TOFMS分析方法

根据以下升温程序进行分离：起始温度45 ℃保持3 min后，以4 ℃/min升温至150 ℃并保持2 min；以6 ℃/min升温至200 ℃,然后以10 ℃/min升温至230 ℃并保持10 min。第2个烘箱的温度全程保持比一维烘箱高5 ℃。调制补偿温度为20 ℃，调制周期为4 s(热脉冲时间0.8 s)。样品运行采用恒流模式，载气为高纯He(纯度>99.999 5%)，流速为1 mL/min。

1.2.3 质谱条件

离子源电压为70 eV，温度为230 ℃，传输线温度为240 ℃,检测器电压为1 430 V,采集质量数范围为35～400 amu，采集频率为100 spectra/s。

1.2.4 数据处理

青稞酒中挥发性化合物的鉴定：试验采集的TOFMS数据由LECO公司软件ChromaTOF进行处理。自动识别信噪比大于50的色谱峰，然后进行自动解卷积和质谱库比对，质谱库为NIST 2014和Wiley 9。12个样品根据春夏秋冬分为4组，采用ChromaTOF软件统计比较功能并对齐色谱峰。峰对齐后，导出1个新的峰表，包含一维时间、二维时间和定量离子等信息。选择3个平行样品中至少出现2次的峰作为这类酒样中存在的组分。筛选相似度大于700的组分，并剔除没有风味贡献的烷烃类化合物、色谱柱流出物和含硅类化合物等，作为初步鉴定结果。在此基础上，相同条件下分析一系列正构烷烃(C7-C30)，确定每个化合物的一维色谱柱保留指数，并与文献报道的保留指数进行比对确认，偏差在30以内的化合物作为可信度较高的结果[17]。通过在模拟酒溶液中添加真实标准品，对比样品与模拟酒溶液中色谱峰的一维时间和二维时间，筛选一维时间偏差在4 s内(1个调制周期)，二维时间偏差在0.1 s内的组分作为最终确认的鉴定结果。

青稞酒中挥发性化合物相对含量的计算：挥发性组分峰面积与内标峰面积的比值与内标浓度的乘积作为该组分在稀释酒样中的相对含量，该数值扩大5倍即为该物质在样品中的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS技术解析青稞酒中挥发性组分

通过GC×GC-TOFMS在冬季酿造的青稞酒中共分离检测到4 491个色谱峰，图1展示了冬酿青稞酒中挥发性组分的全二维分析谱图，每一个黑点代表鉴定的一个化合物。

图1 青稞酒样品HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析的总离子流色谱图(A)及部分细节图(B，C)，化合物编号对应附表S1(图中黑点表示一个色谱峰)

Fig.1 Analytical ion chromatogram contour plot obtained for the HS-SPME-GC×GC-TOFMS analysis of a Qingke liquor (A) and detailed portions (B, C), compound numbers correspond to table S1

232个化合物在一维共流出，部分在二维得到分离。在图2-A中，2-十一醇、(E,E)-2,4-壬二烯醛、十二醛和2-噻吩甲醛4个化合物在一维色谱柱上共流出，2-十一醇和(E,E)-2,4-壬二烯醛在二维色谱柱上同时析出，使得定性分析和定量分析都十分困难。2-十一醇和(E,E)-2,4-壬二烯醛的质谱差异较大(图2-B)，基于质谱差异的解卷积功能可以在这种情况下区分这2个化合物。因此，共流出组分之间的干扰得到了有效降低，GC×GC可以检测到更多的色谱峰。

尽管如此，白酒作为一种组分十分复杂的体系，存在许多保留时间接近且质谱相似的化合物。如图3-A所示，戊酸乙酯和3-庚酮的保留时间比较接近，且两者质谱十分相似(图3-B，图3-C)。戊酸乙酯作为白酒中重要的香气物质，浓度远高于3-庚酮[4]，戊酸乙酯的质谱与3-庚酮质谱存在着部分重叠，造成定性分析和定量分析较困难。3-庚酮在冬季样品中经过软件自动处理鉴定为3-庚酮，而在夏季样品中错误鉴定为戊酸乙酯。这可能是因为夏季样品中戊酸乙酯和3-庚酮的质谱干扰比较严重。统计比较(statistic compare)中的峰对齐功能能够通过比较所有样品中该色谱峰的质谱得到一致的结果，降低了出现偶然误差的可能性，该方法一定程度上解决了保留时间接近和质谱相似情况下如何准确鉴定的问题。

冬季青稞酒通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析，基于软件积分解卷积识别出4 491个色谱峰，通过质谱数据库比对选择相似度大于700的色谱峰得到1 494个组分，进一步通过化合物出峰规律比对和保留指数比对初步鉴定出393个组分，并对187个组分进行了标准品比对，其中184个物质的一维时间偏差在4 s内，二维时间偏差在0.1 s内，最终在冬季青稞酒中鉴定出390种挥发性化合物。通过以上鉴定方式，在4个季节酿造的青稞酒样品中共鉴定出448种挥发性化合物。其中酯类最多(129种)，其次是羰基化合物(119种)、醇类(67种)、萜烯类(53种)、呋喃类(27种)、酸类(17种)、含硫化合物(11种)、内酯类(10种)、含氮化合物(9种)和挥发性酚类(6种)，如表1所示。酯类和羰基化合物作为青稞酒中种类最多的化合物，这一结果与其他白酒研究结论一致[11-12]，说明这几类化合物是白酒中普遍存在的挥发性组分。酯类和羰基化合物也是青稞酒中最重要的香气成分，包括3-甲基丁醛、丁酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、异戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和乙酸异戊酯，主要呈水果香和花香，对青稞酒整体风味有重要贡献[19]。一些微量的乙酯类化合物对白酒的香气也有一定的影响，比如4-甲基戊酸乙酯，其呈现草莓香气，香气阈值极低，只有0.01 μg/L(水中)[20]；肉桂酸乙酯呈现蜂蜜和肉桂的香气，香气阈值仅有1 μg/L[21]。(E)-2-辛烯醛作为豉香型白酒中的关键香气化合物，呈现出油脂的香气，在46%乙醇水溶液中的香气阈值仅有15.1 μg/L[6]。

图2 青稞酒HS-SPME- GC×GC -TOFMS分析节选1个调制周期的4个化合物色谱峰(A)和4个化合物的解卷积质谱(B)

Fig.2 Modulated peaks of four compounds found in Qingke liquor acquired by HS-SPME-GC×GC-TOFMS(A) and deconvoluted mass spectra of 4 compounds(B)

图3 青稞酒中2个化合物的色谱峰(A)和2个化合物的解卷积质谱(B)

Fig.3 Peaks of two compounds found in Qingke liquor(A) and (B) deconvoluted mass spectra of 2 compounds(B)

表1 青稞酒中HS-SPME- GC×GC-TOFMS分析鉴定的化合物统计

除了这些在白酒中普遍存在的化合物，本研究在青稞酒中还鉴定出了53种萜烯类化合物(表2)。图4为青稞酒中萜烯化合物在二维色谱上的分布情况，主要包括萜烯、萜烯醇、萜烯醛、萜烯酮和萜烯氧化物等，其数量和种类都十分丰富。其中有43种在青稞酒中被首次鉴定。萜烯类化合物既是白酒中重要的一类香气化合物，也是具有生理活性的一类重要物质。部分青稞酒中鉴定出的萜烯化合物结构式及香气阈值如图5所示。

图4 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析发现的萜烯类化合物的总离子流色谱图(图中黑点表示一个色谱峰)

Fig.4 Contour plot obtained for the HS-SPME-GC× GC-TOFMS analysis of terpenoid compounds found in Qingke liquor, compound numbers correspond to table S1

其中β-大马酮对白酒香气有重要影响，具有苹果、玫瑰和蜂蜜的香气，其在白酒中的香气阈值极低(0.12 μg/L)，是清香型白酒中十分重要的一种香气化合物[4]。里那醇、香叶醇和香茅醇是具有花香特征的重要香气物质，它们的香气阈值分别为13.1、120和300 μg/L[22]，这3个化合物对青稞酒特征香气有重要贡献作用。此外，土味素的香气阈值极低，仅为0.1 μg/L，呈现出土腥味，是白酒中重要的异嗅物质。除了香气作用外，萜烯也是白酒的功能化合物，具有抗癌活性、抗菌活性和镇痛活性等[23]。在青稞酒鉴定出的萜烯中，d-柠檬油精是柑橘精油的主要成分，一直被用作调香剂、食品添加剂，应用于香料中，在抗癌方面也具有重要作用[23]。反式石竹烯、δ-杜松烯、β-紫罗兰酮和橙花叔醇等具有体外抗肿瘤细胞活性的功能[24]。樟脑、4-萜烯醇、异佛尔酮、γ-古芸烯、β-倍半水芹烯、α-姜黄烯和α-杜松醇等具有抗病毒、抗癌、抗炎症等活性[24]。青稞酒中鉴定出的萜烯化合物不仅对风味有重要影响，对青稞酒的健康价值也有一定的贡献，但这些物质的含量和功能还有待进一步解析。

表2 青稞酒中HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定出的萜烯类化合物

注：RT1，一维色谱柱的保留时间；RT2，二维色谱柱的保留时间；相似度，样品中分析物质谱与NIST库中质谱的匹配值；LRIcal，计算的线性保留指数；LRIlit，来自NIST2018数据库中的文献报道线性保留指数；鉴定依据，RI鉴定基于保留指数比对，MS鉴定基于质谱比对，STD基于真实标准品保留时间比对。

图5 青稞酒中的萜烯类化合物结构图及香气阈值。

Fig.5 Chemical structural and odor threshold of terpenes identified in Qingke liquor

注：β-环柠檬醛香气阈值在水中测定[25]，其他萜烯类化合物香气阈值均在46%乙醇水溶液中测定[4,22]。

2.2 不同酿造季节对青稞酒挥发性组分的影响

维恩图(图6)揭示了4个样品中挥发性组分的相互关系，4个季节酿造青稞酒中的挥发性组分中有299个化合物被共同检出，每一个酒样特异检出的化合物约有10个。

图6 四个青稞酒样品经HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定的化合物种类间的关系

Fig.6 Correlation of volatile compounds identified in 4 Qingke liquors analzed by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

将青稞酒中鉴定出的448种挥发性组分的峰面积与内标峰面积相比，得到标准化数据。随后进行PCA分析，结果如图7所示。2个主成分总计代表了所有变量的79.08%，代表了大部分的变量信息。通过PCA分析，不同季节的样品得到了很好的区分，表明不同季节样品的挥发性组分含量存在较为显著的差异。

C-春季青稞酒；X-夏季青稞酒；Q-秋季青稞酒；D-冬季青稞酒

图7 主成分分析区别4类样品

Fig.7 PCA analysis for distinction between the 4 types of samples

为了进一步分析不同季节酿造的青稞酒中挥发性风味组分差异特征，通过非参数检验(Mann-Whitney U检验)分析青稞酒中448个挥发性组分相对含量的差异，发现4类样品两两之间具有显著差异(P<0.05)的化合物有312个。以312种化合物建立PLS-DA模型并得到变量投影重要性值(variable importance in the projection, VIP)大于1的83种化合物作为关键特征性组分，分析不同季节青稞酒挥发性组分的差异。根据83个特征组分的半定量数据，使用Pearson相关系数得到HCA结果，如图8所示。4类青稞酒最大的差异是生产过程中环境温度不同，春季、夏季和秋季温度较高，有利于微生物的生长，适宜大量风味物质的产生积累，而冬季则相反。图8组A中的化合物在夏季酿造的青稞酒中含量最高，其中β-大马酮是清香型白酒的关键香气物质，具有花香和蜂蜜的香气，同时具有极低的香气阈值(0.12 μg/L)[4]。也存在多种醛类物质，如(Z)-2-癸醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(Z,Z)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛，其中(E,E)-2,4-癸二烯醛呈脂肪香气并具有极低的香气阈值(7.71 μg/L)[6]，烯醛类物质对夏酿青稞酒特征香气具有重要贡献作用。图8组B中的化合物为春季酿造的青稞酒的特征组分，数量多且种类丰富，并呈现不同的香气特征。其中1-辛烯-3-酮是呈类似蘑菇的香气，具有极低的香气阈值(0.016 μg/L)[26]。二甲基三硫是芝麻香白酒中重要的香气化合物，具有烂白菜的香气，香气阈值为0.36 μg/L[7]。肉桂酸乙酯是葡萄酒中重要的香气组分，呈现蜂蜜和肉桂的香气，香气阈值仅有1.1 μg/L[21]，这些物质对春季酿造青稞酒的独特风味可能有较大贡献。图8组C中的化合物是秋季酿造青稞酒的特征组分，其中2,3-二甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪在酱香型白酒中有较高浓度[27]，主要呈现焙烤的香气[28]。4-甲基戊酸乙酯呈现水果的特征香气[7]，在水中的阈值只有0.01 μg/L[20]。2-壬酮具有甜香和水果香的特征香气，香气阈值为483 μg/L[28]。其他风味物质的香气和含量还需进一步解析。

图8 4类样品的83个显著性差异化合物的热图分析和HCA聚类分析

Fig.8 Heat map and HCA clustering results of 83 compounds with a significant difference in the 4 types of Qingke liquor

注：A、B、C组分别为夏季、春季和秋季青稞酒特征组分。

3 结论

本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS解析了青稞酒中挥发性组分特征。在软件积分解卷积、质谱数据库比对进行化合物初步鉴定的基础上，进一步通过化合物出峰规律比对、保留指数比对、标准品比对的方式在青稞酒中鉴定出448种挥发性化合物。二维分离和解卷积功能有效提高了色谱峰的数量，检测出的化合物数目远高于一维气相色谱，显示出卓越的峰容量优势。此外，通过峰对齐功能比较分析物在多个样品间的质谱进一步降低了出错率。青稞酒中的挥发性组分除了白酒中普遍存在的酯、醇、酸和羰基化合物外，还存在53种萜烯类化合物，其中43种首次被鉴定出，这些组分对青稞酒独特的香气特征具有重要贡献作用。不同季节酿造的青稞酒中挥发性组分含量上的差异造成了风味的明显不同，通过多元统计分析找到了83个化合物。该方法可以用来鉴定白酒挥发性组分，寻找挥发性组分与白酒品质之间的关系。