丙泊酚对兔小肠缺血再灌注损伤的影响

田 丹，田 苗，张蕾蕾，李金龙

（1.吉林大学第二医院麻醉科，长春 130041；2.吉林大学第二医院妇 产科，长春 130041；3.吉林大学第二医院胃肠营养及疝外科，长春 130041）

小肠缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）损伤指的是由于出血、创伤、感染性休克、严重烧伤，及某些外科处理过程（如小肠移植、腹主动脉手术或心脏旁路手术等）等情况导致的一种情况[1]。众所周知，小肠I/R不仅可导致小肠本身的损伤，亦可因为小肠粘膜屏障的损伤造成多器官功能失调。I/R后小肠黏膜功能的损害机制相当复杂，活性氧（ROS）诱导的脂质过氧化是目前所知致使小肠黏膜损伤的主要因素之一，而去除氧自由基也成为减轻小肠I/R后损伤的重要手段。显而易见，早期预防并干预小肠缺血再灌注损伤有着重要的临床意义。最近亦有研究表明，在动物模型中，使用镇静剂量的异丙酚治疗，尤其是预处理，可以减轻肠I/R诱导的肠粘膜损伤[2-4]。在本研究中，我们将探讨丙泊酚对肠I/R后肠损伤的保护作用。

1 材料和方法

1.1 试剂 丙泊酚注射液（英国阿斯利康公司）， 邻联二回香胺（美国Sigma 公司）， 1, 5-戊二胺（美国Sigma公司）， 二胺氧化酶标准品（diamineoxidase, DAO，美国Sigma 公司）， 辣根过氧化物酶（上海丽珠东风生物技术有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）、考马斯亮蓝测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），原位凋亡细胞TUNEL（末端转移酶介导的切口末端标记法）检测试剂盒、蛋白酶K 、DNA 酶Ⅰ（DnaseⅠ）（德国Roche 公司），其余试剂或为进口分装生物学级或为国产分析纯试剂。

1.2 动物模型的建立 4～6月龄新西兰兔40只[吉林大学基础实验动物中心提供，许可证编号：SCXK-（吉）2010-0006]， 雌雄各半， 体质量2.5～3.5 kg，手术前禁食12 h ， 自由饮水。术前用3%苯巴比妥（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，取缘静脉开放输液通道输注乳酸林格液。取腹部正中切口，显露肠系膜上静脉（SMA）。除对照组，其他3组动物均在分离SMA15 min后夹闭SMA 60 min，然后开放SMA，并于开放后120 min处死。对照组仅显露SMA，不进行夹闭，其他处理相同。

1.3 动物分组 随机分为4 组，每组10只。肠缺血再灌注组（I/R组）：肠缺血60 min，再灌注120 min；丙泊酚预处理组（P1 组）：在兔肠缺血前10 min 静脉注射丙泊酚10 mg/kg ，后持续静脉注射丙泊酚10 mg/kg/h，余处理同肠I/ R 组；丙泊酚处理组（P2 组）：在兔肠再灌注前10 min 静脉注射丙泊酚10 mg/kg ，后持续静脉注射丙泊酚10 mg/kg/h， 余处理同肠I/R 组；对照组（C 组），即假手术组。所有兔在实验过程中，均以乳酸林格液10 mL/kg/h持续输注。

1.4 标本制备 将实验兔进行全血抽取，然后进行低温下离心，保留上层血浆以待检测二胺氧化酶（DAO）的含量。选取小肠回盲部15 cm 以上的肠管组织，用冰盐水进行漂净，滤纸吸干水分后，取部分组织进行液氮分装冻存，用以待检测小肠组织中的DAO、SOD、MDA 和MPO 。另一部分的小肠组织则用多聚甲醛进行组织固定，制备石蜡切片后分别行H-E染色，用TUNEL染色法行细胞凋亡的检测。

1.5 指标测定

1.5.1 肠组织SOD 、MDA 、MPO 的测定 按试剂盒说明书所授方法进行测定。

1.5.2 肠组织及血浆DAO 的测定 按黎君友等[5]所用的测定方法进行检测，肠组织蛋白含量测定按北京索莱宝科技有限公司试剂盒说明书进行。

1.5.3 小肠损伤程度评分 行H-E染色后，于400×显微镜下随机选取5个视野（非重叠）来观察小肠组织的受损程度并进行评分， 取其平均值用于统计。评分为，0 分：正常绒毛与腺体；1 分：部分绒毛顶部上皮轻度受损；2 分：上皮下腺体轻度受损；3 分：上皮下间隙扩大， 毛细血管充血；4 分：上皮与固有层呈中度分离， 腺体受损；5 分：部分绒毛顶部脱落；6 分：绒毛顶部脱落明显，毛细血管扩张；7 分：绒毛的固有层有脱落， 腺体受损明显；8 分：固有层开始消化分解。

1.5.4 肠组织细胞凋亡的TUNEL法检测 石蜡切片脱蜡入水；蛋白酶K（20 μg/mL，10 mU 溶于TrisHCl 中）37 ℃孵育消化20 min，PBS 洗涤5 min×2 次；滴加TUNEL反应混合液， 37 ℃孵育60 min，PBS 洗涤5 min ×3 次；加入 POD 转化液 50 μL ，37 ℃孵育30 min，PBS 洗涤 5 min ×3 次；加入 DAB 底物 100 μL，室温显色10 min ，PBS 洗涤3 次；苏木精复染，中性树胶封片。阳性对照组在加入TUNEL 反应混合液之前，先加入DnaseⅠ工作液，于37 ℃条件下孵育35 min ，其余操作采用如上方法。阴性对照组则用不含末端转移酶的标记溶液。

结果判断：在光镜下观察，可见凋亡细胞的胞核染色为棕褐色，往往深浅相间； 染色质则为聚焦状态或呈核碎片状。于20×15倍显微镜下用数码相机照相。在400倍显微镜下，任意选取5个非重叠视野，计数凋亡细胞的数目，然后取其平均数值以用于统计学分析。

1.6 统计学分析 采用SAS9.4统计软件进行统计处理。所有数据以均数±标准差（± s） 表示，组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）人方法，以P＜0 .05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆和肠组织二胺氧化酶（DAO）活性 血浆及肠组织DAO水平与对照组（C组）相比，其他3组中血浆的DAO 水平均有不同程度的升高，但仅在缺血再灌注组（I/R组）有显著性差异（P＜0.01）；而其他3组肠组织DAO的 水平则都有所下降， 但仅在I/R 组有显著性差异（P＜0.05）； 丙泊酚预处理组（P1组）中肠组织DAO 水平高于I/R组和P2 组， 与I/R 组相比较则有显著性差异（P＜0.01）。见图1。

图1 血浆和肠组织二胺氧化酶（DAO）活性

2.2 小肠损伤评分和细胞凋亡记数 在H-E染色后于光镜下观察，对照组（C组）的小肠黏膜形态基本正常。而其余3 组小肠黏膜则有多部位不同程度绒毛上皮脱落，毛细血管的扩张和淤血，黏膜下组织水肿等肠黏膜的损伤，3组损伤程度评分都非常显著地高于C 组（均P＜0.01），3 组间差异无统计学意义。见图2a。于光镜下进行观察，C 组仅见少数细胞凋亡情况的发生。肠缺血再灌注组后则细胞凋亡情况明显加重， 其余3 组与C 组比较有显著性差异，缺血再灌注组最为严重（P＜0.01）。使用丙泊酚预处理后兔小肠细胞凋情况有所减轻， P1 组与I/R 组比较有显著性差异（P＜0.01）。见图2b。

图2 小肠损伤评分和细胞凋亡记数

注：与C组比较，*P＜0.05；与C组比较，**P＜0.01；与I/R组比较，## P＜0.01

2.3 肠组织SOD、MDA、MPO变化 与对照组（C组）相比较， 另3组兔肠组织的SOD 活性下降，MDA 水平有所升高， MPO 活性亦升高， 在缺血再灌注组（I/R组）差异有显著性差异（SOD：P＜0.01，MDA：P＜0.05，MPO：P＜0.05）。图3a、3b、3c。P1 组SOD 活性和MDA水平与I/R 组比较差异有显著性意义（均P＜0.05），而在P1与P2 组则改变情况略有减轻。见图3a、3b。

图3 各组肠组织SOD，MDA，MPO水平

3 讨论

肠道黏膜组织对缺血、缺氧表现出异乎寻常的敏感，短时间的缺血和缺氧即可造成肠黏膜功能的损害，进而破坏肠黏膜的屏障功能，造成细菌移位（bacteria translocation），从而损害机体的生理功能。已有研究表明，对于肠系膜上动脉（SMA）阻闭1 h后，再给予3 h灌注，可造成明显的小肠上皮细胞凋亡。细胞凋亡是I/R损伤引起肠黏膜细胞死亡的主要方式。因此，丙泊酚对小肠I/R所致肠粘膜损伤的保护作用可能至少部分归因于预防肠粘膜细胞凋亡。

二胺氧化酶（DAO），又被称为组胺酶，是一种与代谢、氧化及组胺代谢相关的酶。通常情况下，在人类或哺乳动物的的消化道中，DAO的表达相当活跃；而在血液循环系统中，则DAO的含量微乎其微。而在消化道尤其是肠黏膜受到损害时，DAO可从组织中进入血液循环当中，从而引起血浆中DAO含量的增高。消化道中的DAO也可由于组织破坏而有所升高。因此，当血浆和/或消化道中DAO含量升高时，就暗示有可能消化道黏膜细胞的损害发生。本次实验结果表明，与对照组相比较，兔肠缺血再灌注（I/R）后， 肠组织内的DAO 活性明显降低，而血浆中的DAO 活性则显著升高——此种情况说明在小肠I/R 后有黏膜细胞受损并发生脱落。光镜下H-E染色显示，缺血再灌注（I/R）后小肠出现明显的黏膜组织水肿、毛细血管血液淤滞等情况，与对照组相比损伤情况明显增高。进而行原位细胞凋亡检测，显示缺血再灌注（I/R）兔肠组织细胞凋亡数目明显增多。这些结果表明，兔肠缺血再灌注（I/R）后，小肠黏膜组织受到明显的损害，黏膜细胞发生明显凋亡现象。

氧化应激是导致肠缺血/再灌注损伤的主要因素之一。在我们的研究中，肠I/R损伤与损伤组SOD活性显著降低和脂质过氧化产物MDA增加有关。丙泊酚治疗可提高SOD活性，降低MDA的生成。Yagmurdur等人最近的一项研究表明，丙泊酚，但不是静脉麻醉的氯胺酮，可防止烧伤引起的脂质过氧化增加和减少大鼠肠粘膜上皮细胞凋亡，这种作用可能归因于丙泊酚的抗氧化特性[6]。

在给予丙泊酚后，缺血再灌注后的肠组织受损情况虽然并无显著性的降低，但在组织中， DAO活性的下降幅度则有所减少；而在血浆中，DAO的上升幅度同样有所减少。而在丙泊酚预处理组（P1组）中的情况为肠组织 的DAO活性明显高于缺血再灌注（ I/ R）组。这充分说明在使用丙泊酚后，兔肠组织在缺血再灌注时，发生的肠绒毛组织破坏明显减少。经肠组织原位细胞凋亡的检测则显示，经丙泊酚预处理的兔肠黏膜细胞凋亡的数目比缺血再灌注（I/R）组减少，在 P1组差异有显著性意义。以上情况表明，应用丙泊酚预处理可以减轻兔肠缺血再灌注（I/R）后肠组织的损害。而在肠组织损伤发生、发展过程中，肠组织和血浆中的肠黏膜标记酶 DAO的变化要早于形态学改变。因此，通过对血浆和肠组织中DAO变化的测定，则可以反映肠损害的发展情况和程度。

丙泊酚对组织的保护作用可能通过如下机制发生作用：1）抗氧化作用。丙泊酚是一种极好的自由基清除剂，在体内和体外研究都表明它能增强各种组织的抗氧化能力。这种丙泊酚效应的机制尚不清楚，但它可能归因于丙泊酚的预处理样效应，如我们之前所描述的。I/R可损伤肠屏障，进而引起肿瘤坏死因子和白细胞介素-6等促炎细胞因子的释放。研究表明，丙泊酚在体内和体外均可减弱细胞因子（肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6）对内毒素血症的反应[7-8]。2）抑制炎性细胞反应。活性氧和氧自由基的一个重要来源是中性粒细胞和巨噬细胞。这些炎性细胞在呼吸爆发过程中释放活性氧和氧自由基以对抗入侵的细菌。虽然这种活性氧和氧自由基的产生可有效地杀灭或抑制侵入机体的细菌，但是过度的产生因炎症反应过重而导致局部组织损伤。因此，炎性细胞在肠I/R损伤中的过度活跃可引起组织的损伤。消除多余的活性氧和超氧化物歧化酶，可能是治疗肠道I/R损伤的备选方案之一。总之，我们的研究表明，在动物模型中使用镇静剂量的丙泊酚治疗或预处理，可以减轻肠I/R诱导的肠粘膜损伤。当丙泊酚用于心脏大手术后的有意识镇静或用于有胃肠缺血危险的危重病人时，需要进一步研究以确定这种治疗作用在临床上的效果。目前的结果支持了我们先前的假设，即丙泊酚在发挥镇静效用的同时，亦可产生麻醉预处理的有益效果。