阿司匹林对人牙龈成纤维细胞增殖及凋亡的影响

邱燕玲 聂敏海 余丽 陈雨荷 刘旭倩

临床观察发现同时患有心血管疾病和牙周炎的患者，在服用阿司匹林后牙龈易出血，牙周炎症状较重，牙龈指数(GI)、龈沟出血指数(SBI)、探诊深度(PD)、附着丧失(AI)、松动度(M)等均较未服用阿司匹林者呈现更严重的临床表现。阿司匹林是临床常用药物，广泛用于心血管疾病、合并心血管疾病的糖尿病，以及结直肠癌一级预防[1]、高危妊娠女性先兆子痫预防[2]等。诸多研究表明，阿司匹林和牙周炎关系密切。Du等[3]研究发现在富含血小板纤维蛋白的环境中，阿司匹林的缓慢释放可促进牙周韧带间充质细胞的增殖和迁移。Ding等[4]通过临床对照研究发现，长期服用小剂量阿司匹林的慢性牙周炎和冠心病患者，在不停药的情况下，可正常开展牙周病的机械治疗，能够正常止血。Elkhouli[5]通过随机双盲法实验，发现在出现2级分叉的牙周病变患者中，同时服用小剂量阿司匹林者比单纯植骨者牙周袋深度减低、临床附着增加，表明植骨与阿司匹林联合治疗可有效控制牙周炎症。牙周病治疗的目的即是获得牙周支持组织的再生，人牙成纤维细胞(human gingival fibroblasts，HGFs)作为牙周膜和牙龈最主要的细胞，是牙周支持组织的重要组成部分，是诱导牙周组织再生的基础细胞，进一步探讨阿司匹林对HGFs的影响，将为牙周病的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牙龈组织来源 健康青少年牙龈组织取自西南医科大学附属口腔医院颌面外科门诊，经患者和/或监护人同意并签署知情同意书后，切取少量下颌阻生智齿拔除时无炎症牙龈，患者年龄18～24 岁。

1.1.2 主要试剂和药品 阿司匹林(Sigma，美国)，实验前取18.0 mg阿司匹林粉末溶解于0.1 ml二甲基亚砜(Sigma)，加入10 ml完全培养基，配置10 mol/L的阿司匹林培养液，0.22 μmol/L滤膜(Sigma)过滤除菌后4 ℃保存，待配成所需浓度。DMEN低糖培养液(HYCLONE，美国)，含15%胎牛血清(HYCLONE)、2%青链霉素(HYCLONE)。MTT试剂盒(Sigma)，CCK-8试剂盒(碧云天)，细胞凋亡检测试剂盒(凯基)等。

1.1.3 主要仪器 2300型恒温CO2培养箱、EPICS XL型流式细胞仪(Coulter公司 ，美国)，KDC-1044低速离心机(安徽中科中佳)，自动酶标光度仪(Biotect，美国)，倒置显微镜(SHELLAB，美国)等。

1.2 方法

1.2.1 HGFs的分离与培养 取18～24 岁健康青少年阻生智齿拔除时小部分牙龈组织，通过组织块贴壁法进行原代培养。待细胞长至80%～90%时，常规胰酶消化传代[6]。

1.2.2 HGFs的鉴定 免疫组化SP法鉴定细胞来源。滴定细胞爬片，10%甲醛固定，分别进行抗Vimentin抗体和抗CK抗体孵育，倒置显微镜观察染色结果。

1.2.3 MTT法检测增殖 分别取第2至第5代HGFs消化制备成1×105/ml的单细胞悬液，接种于96 孔板，每组设4 个复孔，酶标仪于24、48、72、96 h检测相应A值，绘制细胞的增殖曲线。

1.2.4 CCK-8检测阿司匹林促增殖浓度范围 取处于对数生长期的第3代HGFs，胰酶消化制备成1×105/ml的单细胞悬液，接种于96 孔板，实验分11 组，9 个实验组(A-I)，1 个空白对照组(J)，1 个对照组(K)，每组设6 个复孔。A-I组分别加入0.25、0.5、0.8、2、4、6、8、10、12 mol/L阿司匹林培养液各100 μl；J组不加细胞，不加阿司匹林，为空白对照组；K组加检测细胞，为对照组。边缘孔填充无菌PBS，5%CO2培养箱培养24 h后换液。分别于24、48、72 h，各加入CCK-8液10 μl，酶标仪检测A值，绘制不同浓度阿司匹林处理后在不同时间点的A值柱状图。

1.2.5 流式细胞仪检测HGFs的凋亡 实验分组同上，每组4 个复孔。处理48 h后PBS洗涤，不含EDTA的胰酶消化制备成5×105/ml的单细胞悬液，加入500 μl的Binding Buffer 悬浮细胞，加入5 μl的Annexin V-EGFP混匀后，再加入5 μl的Propidium lodide混匀，室温、避光反应15 min左右，流式细胞仪检测[7]。

1.3 统计学方法

使用SPSS 17.0进行统计学分析。多组均数间比较，采用单因素方差分析。P<0.05认为结果具有统计学差异。

2 结 果

2.1 HGFs的分离与培养结果

本实验收集12 例牙龈组织，均在6 d左右开始有细胞游出，以组织块为中心成放射状排列(图 1A)。分别采集不同代次细胞倒置显微镜下图像，观察到细胞传代后贴壁良好，生长速度快，形态稳定，呈梭形或纺锤形，有多个较长突起，包浆丰满，核呈圆形或卵圆形，有1～3 个核仁。细胞长至底壁80%左右，开始呈现漩涡状、栅栏状(图 1B) 。

图 1 HGFs原代培养(A)和传代培养(B) (倒置显微镜, A: ×100; B: ×40)

Fig 1 The primary(A) and passage(B) culture of HGFs (Inverted microscope, A: ×100; B: ×40)

2.2 MTT最佳代次选择结果

图像近似“S”形，接种24～48 h生长较为缓慢，48～72 h生长最为迅速，72 h后细胞数量趋于稳定，之后缓慢下降。细胞生长曲线呈“滞缓-对数生长-平台”模式(图 2)。

2.3 免疫组化鉴定结果

免疫组化结果显示：细胞Vimentin蛋白染色阳性，胞浆均质黄染(图 3A)。CK蛋白染色阴性，胞浆不着色(图 3B)。

图 2 第2～5代细胞增殖曲线

2.4 不同浓度阿司匹林对HGFs增殖的影响

不同浓度药物组与对照组A值在24～96 h呈先上升后下降趋势，在72 h，A值达到最大(图 4)。低浓度组(0.25、0.5、0.8 mol/L)与对照组相比，A值均高于对照组(P<0.05)；中高浓度组(2、4、6、8、10、12 mol/L)与对照组相比，A值明显减低(P<0.01)。低浓度组组内、中浓度组组内、高浓度组组内A值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5 不同浓度阿司匹林作用下HGFs的凋亡情况

随着阿司匹林浓度增加，细胞凋亡增多。各组内单因素方差比较，差异无统计学意义(P>0.05)，组间差异有统计学意义(P<0.05)(图 5)。

图 3 波形丝蛋白(A)和角蛋白(B)在HGFs中的表达 (IHC, A: ×100; B: ×200)

Fig 3 Vimentin(A) and Keratin(B) expression of HGFs (IHC, A: ×100; B: ×200)

图 4 不同浓度及时间阿司匹林对HGFs增殖的影响

Fig 4 The proliferation of HGFs treated with various concentration of aspirin and for different period

图 5 不同浓度阿司匹林作用下HGFs的凋亡情况

3 讨 论

阿司匹林在最初因镇痛、退热作用被广泛使用，后又发现其具有良好的抗血栓、消炎以及治疗心血管疾病、糖尿病，预防高危妊娠女性先兆子痫等作用。长期临床观察以及实验研究，发现阿司匹林不仅通过抗凝途径对牙周病产生影响，还直接对牙周组织产生影响。Li等[8]研究表明，牙周病的炎性环境导致组蛋白乙酰转移酶GCN5表达降低，从而降低牙周韧带干细胞的成骨分化。通过动物实验，发现注射阿司匹林可上调GCN5、控制牙周炎症、促进牙周韧带干细胞成骨分化。而Rahman等[9]研究也发现阿司匹林可调节生长相关基因的表达以及促进牙周韧带干细胞的成骨分化。也有对照研究表明[10]，氯吡格雷可显著降低炎性浸润,促进胶原纤维数量增加，而对照组阿司匹林在牙周炎的使用中不能防止骨质流失。这些研究主要集中在阿司匹林对牙周韧带干细胞、成骨细胞的影响，而HGFs作为牙周组织最重要的细胞之一，目前国内外少见有报道。HGFs是牙龈结缔组织中的主要细胞，具有活跃的自我更新能力，不仅可以合成胶原纤维、弹力纤维，同时也是结缔组织基质的重要组成成分，王坤等[11]研究发现HGFs具有一定的潜在成骨能力，有望成为牙周组织工程的种子细胞；牙龈组织较牙周膜来源更为广泛，取材时创伤较小，取材量更大，且体外培养牙龈成纤维细胞成功率高于牙周膜成纤维细胞；在牙周炎初期，炎症首先波及牙龈组织，因此建立HGFs模型将有利于对牙周病发病机制的探讨及牙周病防治。

本实验以HGFs为切入点，进行HGFs培养，免疫组化鉴定，MTT最佳代次选择，通过不同浓度阿司匹林作用后检测细胞增殖和凋亡，以探讨阿司匹林对HGFs是否有影响。

本实验采用经典的组织块贴壁法，操作简便，成功率高。在培养过程中，可见有立方状上皮细胞首先游出，但HGFs增殖能力明显强于牙龈上皮细胞，且胰酶消化时，HGFs敏感性强，可首先被消化分离，通过多次传代消化，HGFs可得到充分纯化。免疫组化SP法显示，细胞抗Vimentin染色阳性，抗CK染色阴性，证明细胞来源于中胚层[12]，结合取材部位，可充分证明细胞是牙龈成纤维细胞。体外细胞实验需要良好的细胞状态，本实验设计MTT最佳代次选择实验，绘制细胞生长曲线，结合细胞形态学观察，显示第3代HGFs形态稳定，状态良好，增殖速度快，适用于实验研究。

本实验选用第3代HGFs，通过加入不同浓度阿司匹林，检测细胞的增殖情况。阿司匹林浓度范围的确定则基于文献以及前期的预实验。CCK-8结果显示：低浓度阿司匹林(≤0.8 mol/L)对HGFs有促进增殖作用，中高浓度(≥2 mol/L)阿司匹林则明显抑制细胞增殖，且浓度越高，抑制作用越明显。考虑原因为：阿司匹林作为一种酸性药物，PH过低可影响细胞活性，随着药物浓度的增加，PH可明显降低，故对细胞活性影响较大。而在较低浓度，培养基PH变化不大，故对细胞活性影响不大，未能掩盖阿司匹林本身对细胞的促增殖作用。因此本实验可进一步改进：调节加药后培养液PH以减少培养液酸碱性对细胞活性的影响；缩小药物浓度间隔以找到最佳促增殖浓度以及最低抑制浓度。在凋亡试验中，实验分组同增殖实验。检测结果仍表明在组内无统计学差异，组间比较有统计学差异。故实验结果图分别选用了空白组、0.5 mol/L组、4 mol/L组、10 mol/L组。因实验分组并未做到更小量化，且未对培养液进行PH调节，故最低促凋亡浓度需要进一步探讨。