HPLC测定油茶籽油中BaP方法的改进

2019-08-22吴耀祥佘佳荣李玉平

中国油脂 2019年8期

吴耀祥，佘佳荣，李玉平

(湖南省林产品质量检验检测中心，长沙 410000)

苯并芘有苯并(a)芘和苯并(e)芘两种异构体，其中苯并(a)芘(BaP)较为常见，是由5个苯环和芘分子组成的多环芳烃化合物，由肉类、油脂等其他食品被过度加热裂解而产生[1-3]。研究表明，BaP是强致癌物，微小剂量就能引起癌变，对人体细胞具有强烈致突变和致畸性，并可能引起大鼠DNA以及肝细胞损伤[4-6]。目前，世界多数国家已加强对食品中BaP限量管理，相继出台许多关于BaP的强制性最低限量值标准。我国GB 2762—2017规定油脂及其制品中BaP限值为10 μg/kg，欧盟629/2008限值为2 μg/kg[6]。

湖南是我国油茶大省，全省油茶种植林区面积和产量都位居前列[7]。由于BaP对油茶籽油亲和力较强[8]，且加工过程中的高温，常会导致成品油里有一定的BaP残留。因此，建立精准的油茶籽油中BaP检测方法，对提高油茶籽油质量，保护人类健康有着十分重要的意义。现行的BaP检测方法有气相色谱-质谱法[9-10]、HPLC法[11]、HPLC-MS法[12-13]等，而回收率试验是评价一种检测方法好坏的重要指标之一。本文在借鉴相关资料[14-17]的基础上，主要探究提高HPLC法测定油茶籽油中BaP的回收率，并分析导致其回收率低的原因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

二氯甲烷、乙腈均为色谱纯，美国TEDIA公司；正己烷为色谱纯，CNW公司；质量浓度为4.95 μg/mL 甲醇中BaP标准物质(GBE(E)080476，简称BaP标准物质)，中国计量科学研究院。

LC2010A型液相色谱，岛津企业管理仪器有限公司；InertSustain C18色谱柱(5 μm×4.6 μm×250 mm)，岛津技迩商贸有限公司；UGC-12M型氮吹仪；AL204型电子分析天平；15 mL尖底离心管，美国康宁公司；SBEQ-CG1012固相萃取真空装置、500 mg，6 mL BaP分子印迹柱；DG-2500R型多管涡旋混合仪。

1.2 试验方法

1.2.1 GB 5009.27—2016 净化方法

称取0.4 g油茶籽油于15 mL尖底离心管中，加入以乙腈稀释配制的质量浓度为49.5 ng/mL的BaP标准溶液100 μL，后用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min涡旋30 s。

依次用5 mL二氯甲烷、正己烷活化柱子。将待净化液转移至柱子，待液面降至柱床时，用6 mL正己烷淋洗柱子，弃去滤液，用6 mL二氯甲烷洗脱并收集到离心管中，将收集液在40℃氮气下吹干，准确移取0.4 mL乙腈复溶，2 400 r/min涡旋30 s，过0.45 μm微孔滤膜，待HPLC测定。

1.2.2 改进后净化方法

称取0.4 g油茶籽油于15 mL尖底离心管中，加入以正己烷稀释配制的质量浓度为49.5 ng/mL的BaP标准溶液100 μL，后用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min涡旋30 s。

接受理论本为一种文学批评理论,高举读者本身就是作品能动构成的旗帜，认为在作者，作品与读者的三元关系中，读者绝不仅仅是被动的部分，没有读者的积极参与或未达成读者的预期视野，那一部作品的历史生命将是不可思议的。它旨在打破文学作品封闭的圆圈，从一个崭新的视角重新审视作品，即接受理论的视角。

依次用5 mL二氯甲烷、正己烷活化柱子。将待净化液转移至柱子，待液面降至柱床时，用10 mL正己烷淋洗柱子，并适当加压抽干柱子中残留液，后弃去滤液，用6 mL二氯甲烷洗脱并收集到离心管中，将收集液在40℃氮气下吹干，准确移取1 mL乙腈复溶，2 400 r/min涡旋30 s，过0.45 μm微孔滤膜，待HPLC测定。

1.2.3 HPLC条件

等度洗脱；流动相为乙腈0.88 mL/min，水0.12 mL/min；流速1.0 mL/min；荧光检测器激发波长384 nm，发射波长406 nm；进样量10 μL；柱温35℃。

1.2.4 标准曲线的制作

取质量浓度为4.95 μg/mL的BaP标准溶液，用乙腈逐级稀释成质量浓度为49.5 ng/mL的BaP标准储备液，再取标准储备液用乙腈逐级稀释得到质量浓度为0.495、0.99、4.95、9.9、19.8 ng/mL的标准曲线梯度溶液，转至液相进样瓶中，按照1.2.3的色谱条件分析，以质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5 精密度、加标回收率的测定

称取9份0.4 g油茶籽油，分别加入质量浓度为49.5 ng/mL的标准溶液50、100、150 μL，其对应加标质量为2.475、4.95、7.425 ng，平行重复3次，净化后进HPLC分析，代入标准曲线中定量并计算精密度和回收率。

2 结果与讨论

2.1 改进方法条件的确定

2.1.1 加标液稀释溶剂的确定

以乙腈、正己烷分别稀释配制的BaP标准溶液，添加相同加标量，并按照相同的净化方法和色谱条件检测，并对比分析两者的结果，详见表1。

表1 不同标准溶液稀释溶剂的HPLC结果

试验发现，相同的前处理和色谱条件下，两者色谱图峰型无明显差别，出峰时间均在12.5 min左右，峰型好且无拖尾现象，说明该法能使BaP得到较好分离。但正己烷稀释的峰高、峰面积均比乙腈稀释的高(见表1)，说明乙腈稀释的回收率较低，这可能是因为乙腈与油茶籽油亲和力较差，在油茶籽油中几乎不溶，导致BaP大量残存在乙腈溶液中，并没有完全溶入油茶籽油；在以正己烷淋洗时把乙腈中的BaP大量洗脱，致使回收率低。而正己烷与油茶籽油亲和力强，溶解度大，涡旋时能与油茶籽油均匀混合，则能很好避免淋洗过程中BaP的大量流失。因此，选择以正己烷稀释BaP标准溶液作为样品加标液。

2.1.2 正己烷淋洗体积的确定

称0.4 g油茶籽油，添加正己烷稀释的质量浓度为49.5 ng/mL的BaP标准溶液100 μL，立即用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min涡旋30 s，取出，转移至活化好的柱子中，待样液降至柱床时，分别以6、10 mL正己烷淋洗，后续步骤以1.2.2方法处理，比较两者液相色谱分析的结果见表2。

表2 不同体积正己烷淋洗的HPLC结果

从表2可以看出，不同体积的正己烷淋洗后的分离效果都较好，但以10 mL正己烷淋洗后的谱图峰高较高，峰面积明显较大，说明信号响应值高，BaP检出值大。可能是因为对于0.4 g油茶籽油，当正己烷淋洗体积为6 mL时，其淋洗程度略显不够，会导致油茶籽油洗脱不完全，净化不彻底，会随着二氯甲烷洗脱时一起流入试管中，污染净化液，影响结果。试验发现，加大正己烷淋洗体积至10 mL，分数次洗涤，后适当加压使柱中残留液全部流出，再以二氯甲烷洗脱，其效果更好。因此，选择以10 mL正己烷淋洗。

2.1.3 乙腈复溶体积的确定

称0.4 g油茶籽油，添加正己烷稀释的质量浓度为49.5 ng/mL的BaP标准溶液100 μL，立即用5 mL正己烷溶解，2 400 r/min涡旋30 s，取出，转移至活化好的柱子中，待样液降至柱床时，以10 mL正己烷淋洗，6 mL二氯甲烷洗脱，分别以0.4、1 mL乙腈复溶。结果发现添加0.4 mL乙腈不能很好地溶解样品，而1 mL乙腈可完全溶解样品，因此选择1 mL乙腈进行复溶。