HPLC同时测定翻黄合剂中芍药苷和盐酸小檗碱含量

陆凤琪，周海嫔，陈文成，甘斌艳，王亚芳

（1.安徽牧春堂天然药物研究开发有限公司，安徽滁州239000；2.滁州学院，安徽滁州239000；3.北京市兽药监察所，北京102629）

现代中兽医从辨证论治角度分析鸡大肠杆菌病属疫毒内侵、肺胃热盛、血瘀气滞，应以清热解毒、活血行气为主［1］。翻黄合剂是由翻白草、千里光、大黄、黄连、赤芍等药材组成，临床用于鸡大肠杆菌病，具有清热解毒、活血化瘀、燥湿止痢的功效。其质量标准研究只针对盐酸小檗碱进行含量测定，未对赤芍中主要成分芍药苷进行检测，故本文参照有关文献［2-5］，采用高效液相色谱法同时测定翻黄合剂中芍药苷和盐酸小檗碱的含量，为翻黄合剂的质量控制提供科学的依据。

1 材 料

Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪；EX125DZH型电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；UPT-C-5型超纯水机（邦西科技（上海）有限公司）；RE-2000B型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ3200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

翻黄合剂为安徽牧春堂天然药物研究开发有限公司制备（批号：20190319）。芍药苷对照品（批号：110736-201741），盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201613），以上均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，中性氧化铝（200-300目），盐酸、甲醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液的制备 分别取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的芍药苷和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成芍药苷浓度为99.76 μg／mL、盐酸小檗碱浓度为 23.85 μg／mL 的混合对照品溶液，摇匀，滤过，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取翻黄合剂10 mL，置具塞锥形瓶中，加盐酸0.1 mL，85 ℃水浴30 min，超声处理（功率 150 W，频率 40 KHz）20 min，加于中性氧化铝柱（200 ～300 目，5 g，内径为1 cm）上，用甲醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇50 mL使溶解，转移置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.3 未过柱纯化供试品溶液的制备 精密量取翻黄合剂10 mL，置50 mL量瓶中，加盐酸0.1 mL，85℃水浴30 min，加甲醇30 mL，超声处理（功率150 W，频率40 KHz）20 min，放冷，加甲醇定容至刻度，滤过，精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣加甲醇10 mL使溶解，转移置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方组成与制剂工艺，制备缺赤芍和黄连的阴性样品，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。

2.2 色谱条件 YMC-Pack Pro C18（250 mm ×4.6 mm）；流动相A为乙腈，B为0.15%磷酸溶液，梯度洗脱程序见表1；流速为1.0 mL／min；柱温为26℃；检测波长为245 nm。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient eluted program

2.3 供试品溶液制备工艺与系统适用性试验 按上述色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液、未过柱纯化供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL进样，记录色谱图。理论板数按芍药苷和盐酸小檗碱峰计算不低于4000，芍药苷保留时间为13.828 min，盐酸小檗碱保留时间为28.623 min，峰型对称，无杂质干扰且基线平稳，阴性无干扰。见图1。

图1 HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 线性关系考察 分别取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h的芍药苷和盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成芍药苷浓度为491.96 μg／mL、盐酸小檗碱浓度为 102.50 μg／mL 的母液。加甲醇将母液进行倍比稀释，分别稀释成芍药苷浓度为 491.96、245.98、122.99、61.49、30.75 μg／mL和盐酸小檗碱浓度为 102.50、51.25、25.63、12.81、6.41 μg／mL 的对照品溶液。 各进样 2 次，进样体积10 μL，按上述色谱条件测定。以芍药苷和盐酸小檗碱峰面积为纵坐标（Y），以对照品进样量为横坐标（X），绘制标准曲线。见表2。

表2 线性关系Tab 2 Linear relationship

2.5 精密度试验 精密吸取芍药苷和盐酸小檗碱混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，按上述色谱条件测定，结果芍药苷和盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.14%和0.76%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件测定，分别于0、2、4、6、8 h 后进样，进样量为10 μL，测定峰面积。结果芍药苷和盐酸小檗碱峰面积的 RSD 分别为1.32%和0.57%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.7 重复性实验 取同一批的翻黄合剂（批号为20190319），按2.1.2 所述方法平行制备 6 份供试品溶液，进样测定含量。结果芍药苷和盐酸小檗碱含量的 RSD 分别为0.90%和0.64%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的翻黄合剂6份，精密吸取10 mL，分别加入芍药苷6.20 mg和盐酸小檗碱 1.90 mg，加热至完全溶解，按2.1.2 所述方法制备供试品溶液，进样测定含量，计算回收率。见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3 Results cosfficient of recovery test（n ＝6）

2.9 样品含量测定 取三批样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算样品中芍药苷和盐酸小檗碱的含量。见表4。

表4 3批样品中含量测定结果Tab 4 Content determination results of three batch sample

3 讨论与结论

翻黄合剂是由翻白草、千里光、大黄、黄连、赤芍等药材提取精制制成的中药合剂，具有抗菌、抗炎、活血、祛瘀等功效。为了保证药物临床有效性，采用HPLC同时控制翻黄合剂中芍药苷和盐酸小檗碱的含量。翻黄合剂为复方制剂，含有多种化合物，在制备供试品溶液时，直接采用甲醇做溶剂对样品进行稀释，得到的供试品溶液杂质成分多，目标峰基线偏高，杂质峰有干扰，无法测定样品中芍药苷和盐酸小檗碱的含量。采用中性氧化铝柱对供试品溶液进行处理，可以除去部分杂质，使目标峰分离度好，无杂质峰干扰。

为了同时测定翻黄合剂中芍药苷和盐酸小檗碱的含量，对多种流动相进行了选择，选择甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水的不同比例，所得目标峰峰型、分离度均不理想，最后选择乙腈-0.15%磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，经不断调整梯度洗脱比例，所得目标峰出峰时间、峰型、分离度均较好。

综上所述，该方法简单、可靠，可以同时检测翻黄合剂中芍药苷和盐酸小檗碱的含量，为翻黄合剂的质量控制提供了依据。