板蓝根指标成分分布分析及药材质量评价研究

钟昆芮，王亚芳，张连彦，周艳飞，高 婷

（北京市兽药监察所，北京102629）

板蓝根为十字花科菘蓝的干燥根（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，是我国治疗感冒常用传统大宗中药材，能清热解毒、扶正固本，研究表明板蓝根具有抗病毒、抗菌、抗炎、解热、增强机体免疫功能等作用。随着养殖环节兽用抗菌药减量化行动开展，寻求良好的抗生素替代品势在必行，板蓝根既能防病更能治病，在减抗、替抗方面具有优势，种植产区逐年扩大，不同产区板蓝根品质和外观性状差异较大，板蓝根药源稳定性、种植区域选择、药材资源合理规划不确定性凸显［1-3］，因此板蓝根中有效成分含量分布情况和质量评价体系亟待研究补充。

2015版《中国兽药典》中板蓝根注射液含量测定指标成分为（R，S）-告依春，而精氨酸、靛蓝、靛玉红及核苷类成分（鸟苷、尿苷、腺苷）具有抗病毒［4-5］、消炎抑菌［6］、抗氧化［7-8］等药理活性且含量所占比例较高，亦被广泛用作指标成分衡量药材质量。

本文测定并分析河北、甘肃、东北、山东等11个不同产地来源板蓝根中精氨酸、靛蓝、靛玉红、鸟苷、尿苷、腺苷和（R，S）-告依春的含量分布情况，综合多成分进行各产地板蓝根质量评价研究，补充板蓝根药源选择依据，为板蓝根药材资源的合理规划提供参考。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器，Waters e2695高效液相色谱仪，2998 PDA检测器，DTL-500型超声波清洗机（北京德泰隆科技发展有限责任公司），超纯水机（Milli-Q 公司，Advantage A10）。

试剂三氟乙酸和甲醇均为色谱纯（Fisher Chemical），N，N-二甲基甲酰胺为分析纯（北京化工厂），水为自制高纯水。精氨酸（批号140685-201707），鸟苷（批号 111977-201501），尿苷（批号110887-201803），腺苷（批号 110879-201703），靛蓝（批号110716-201612），靛玉红（批号110717-200204），（R，S） - 告依春 （批号 111753-201706），均购自中国食品药品检定研究院。

2 方 法

2.1 指标成分含量测定

2.1.1 精氨酸 色谱柱 ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温 30 ℃；流动相水 -三氟醋酸 （100 ∶0.2），流速 0.3 mL／min；蒸发光检测器漂移管温度110℃，载气流量2.5 L／min。取精氨酸对照品12.5 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取通过3号筛的供试品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞瓶中，精密加流动相50 mL，超声处理30 min，放至室温，滤过；精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.1.2 靛蓝、靛玉红 色谱柱 Kromasil 100-5C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相水 - 甲醇（70 ∶30），流速 1 ml／min，柱温 30 ℃，检测波长250 nm。分别取靛蓝、靛玉红对照品2.5 mg，置同一100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解，超声30 min，N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，作为对照品溶液。取通过3号筛的供试品粉末约5 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加甲醇-三氯甲烷（400∶100）50 mL，超声处理30 min，放冷至室温，滤过，滤液回收溶剂至干，N，N-二甲基甲酰胺溶解，转移至10 mL量瓶，定容置刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 核苷类、（R，S） -告依春 Atlantis T3 色谱柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流动相甲醇（A） -水（B）梯度洗脱（0 ～3 min，3%A；3 ～20 min，3% ～10%A；20 ～40 min，10% ～70%A；40 ～50 min，70%A；50.01 ～60 min，3%A），流速 0.8 mL／min，检测波长245 nm。取通过3号筛的供试品粉末约0.5 g，精密加50%甲醇溶液50 mL，超声30 min，离心（6000 r／min，5 min），取上清液，作为供试品溶液。分别取尿苷、鸟苷、腺苷对照品20 mg精密称定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度。取（R，S）-告依春对照品20 mg精密称定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度。

2.2 指标成分分布分析 采用SPSS 19.0统计软件分析技术，以因子分析提取对不同产地板蓝根评价贡献率大的主因子，进一步选取药材评价指标成分。KMO和Bartlett检验判断变量是否适合因子分析，结合碎石图和因子贡献率选择主因子，因子载荷值经Kaiser标准化正交旋转法旋转以明确因子的含义，选取评价指标成分。根据成分得分系数矩阵计算主因子得分，由此进一步计算不同产地板蓝根综合评分并排序。以选取的评价指标成分含量作为变量，对产地进行Q型聚类分析，聚类方法为组间联接法，样品间距离选择平方Euclidean距离。结合各产地板蓝根因子分析综合得分排名顺序和聚类分析产地分类结果，结合聚类分析结果和因子分析综合排名分析指标成分分布情况，评价各产地板蓝根药材质量。

3 结果与分析

3.1 含量测定 指标成分精氨酸、靛蓝、靛玉红、鸟苷、尿苷、腺苷和（R，S）-告依春含量测定结果见表1。

表1 不同产地来源板蓝根中指标成分含量Tab 1 Index component content of Radix Isatidis from different origins

3.2 评价指标成分选取 KMO和Bartlett检验结果见图1（1），Sig值小于显著水平 0.05，表明7个指标成分间存在相关关系，KMO值越接近1越适合因子分析，发现 KMO 值0.446偏低（ ＜0.5），精氨酸变量共同度0.569偏低，选取除精氨酸外6个指标成分进行KMO和 Bartlett检验，结果见图1（2），KMO 值为 0.638，指标成分变量共同度高，表明指标成分中大部分信息能被因子提取，因子分析结果有效因子特征值碎石图见图2，碎石图以斜率解释变异，可见因子1、2斜率大、连线陡峭，从因子3开始斜率变平缓，此后的因子对变异的解释逐渐减小。因子对板蓝根药材评价的贡献率表见图3，因子1的特征值为 3.866（＞1），占总特征值的64.441%，因子2 的特征值为 1.342（ ＞1），占总特征值的22.365%，结合碎石图和因子贡献率选择因子1和2作为主因子，二者占特征值累积百分比高达 86.806%。

图1 因子分析可行性判断Fig 1 Feasibility judgment of factor analysis

图2 因子特征值碎石Fig 2 Gravel of factor eigenvalue

经Kaiser标准化正交旋转法得到旋转后的因子载荷值，结果见图4～图5，因子1上载荷较大的指标成分为鸟苷、尿苷、腺苷，因子2上载荷较大的指标成分为靛蓝、靛玉红，此5种指标成分对板蓝根药材评价起到关键作用。（R，S）-告依春在主因子1、2上的载荷值均极低，表明其在板蓝根产地差异性解释上贡献小。

各指标成分得分系数矩阵见图6，依据成分得分系数矩阵计算得不同产地来源的11个板蓝根样品因子1、2的因子得分F1和F2，以各因子的方差贡献率为权，由各因子线性组合得到综合评价指标函数Z＝（a1F1＋ a2F2＋… ＋ aiFi）／（ a1＋ a2＋…＋ai），为即板蓝根综合因子得分表达式为Z＝（64.441% ×F1＋22.365% × F1） ／86.806%，以上表达式计算得不同产地板蓝根综合因子得分并排序，结果见表2。

3.3 产地分析 以不同产地来源的11个板蓝根样品中鸟苷、尿苷、腺苷、靛蓝、靛玉红的含量作为变量进行聚类分析，聚类结果见图9，直观分布见图10。

图3 因子贡献率Fig 3 Factor contribution rate

图4 旋转的因子载荷Fig 4 Rotated factor load

图6 成分得分系数矩阵Fig 6 Component score coefficient matrix

图5 旋转空间中的成分Fig 5 Components in the rotating space

表2 主因子得分及综合得分排名Tab 2 Main factor score and comprehensive score ranking

图9 聚类分析树形图Fig 9 Cluster analysis tree

图10 产区分布直观图Fig 10 Production area distribution map

聚类树形图给出聚类每一次合并的情况，将不同产地来源的11个板蓝根样品药材分为三类：东北（1号和5号）、甘肃（8号）和黑龙江（9号）产地距离较近，归为一类，安国（4号）、安徽（6号）、甘肃（3号）、山东（7号）产地距离较近归为一类，根据树形图判断此两类距离较近，品质较为接近。第三类为河北（2号和11号）、东北（10号），此类与前两类距离远，表明这三个产地板蓝根样品与其余样品有明显的差异。

3.4 分布分析和质量评价 各产地板蓝根因子分析综合得分排名顺序见表3，与聚类结果结合分析发现与其他产地距离较远的第三类板蓝根样品综合排名最高，其中排名前二的板蓝根样品产地为河北（11号和2号）表明河北产板蓝根品质最佳。

表3 不同产地来源板蓝根综合排序表Tab 3 Comprehensive sorting of Radix Isatidis from different origins

结合聚类分析结果和因子分析综合排名，板蓝根主要分为三大产区，即东三省北部产区、河北中部产区和甘肃-山东-安徽南部产区，直观图见图10。

4 讨论与结论

东北产10号板蓝根因子分析综合得分排名第三，但聚类第一类板蓝根样品几乎全部产自东北，综合得分排名靠后，观察到10号板蓝根来源与综合得分排名第一的板蓝根样品一致，表明同一产区板蓝根品质存在差异，可能种植技术在一定程度上决定板蓝根品质。甘肃产区3号样品与8号样品综合得分分差较大，且聚类分析结果分属两类，现有研究发现甘肃产区内板蓝根品质差异明显［10-12］，可能与甘肃省板蓝根种植面积广，覆盖地貌丰富有关，可在建立多指标成分评价体系下进一步深入研究板蓝根品质影响因素。

（R，S）-告依春在对不同产地板蓝根差异性解释上贡献小，提示（R，S）-告依春含量不仅与板蓝根产区相关；因子分析中精氨酸变量共同度低，其信息不能大部分地被因子提取，表明精氨酸变量在反映研究对象板蓝根的角度与所建立的评价体系有区别。然而除靛蓝、核苷类成分外，（R，S）-告依春和精氨酸与板蓝根与抑制流感病毒药理活性亦关系密切［4，12］，二者分布规律尚待进一步阐明，由此可从应用角度选择不同评价指标或建立多重评价体系。