不同固定液对小麦小孢子发育和花粉育性检测的影响

刘海英，甄俊琦，茹振钢，董 娜，高 远， 冯必得，张 丽，师学珍

(1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007； 2.河南科技学院小麦研究中心， 河南新乡 453003； 3.河南师范大学新联学院，河南新乡 453007)

利用杂种优势是提高小麦产量最有效的途径之一[1]。C49S[2]、BS210[3]和K78S[4]等温光敏小麦雄性不育系的育成，为“二系法”杂交小麦制种提供了种质保障。研究小麦雄性不育系小孢子发育过程并检测花粉育性的变化，是揭示其败育机理的细胞学依据[5]。

前人对玉米[6]、小麦[7-8]和水稻[9]等作物小孢子发育和育性检测开展了大量研究。目前，常用I2-KI染色法指示小孢子内的淀粉积累情况，用醋酸洋红和DAPI染色法指示细胞核情况。样品固定液主要有FAA和卡诺氏固定液两种，但对这两种固定液在采用不同染色方法时是否会对观察结果产生实质性影响，是何种影响，目前尚未见 报道。

小麦温敏雄性不育系BNS366由河南科技学院茹振钢教授育成，抽穗前低于8.9 ℃的日平均温度可诱导其花粉败育[7,10]，其近等基因系为郑麦366。在本试验前期研究中尝试过用FAA固定液对小麦小孢子进行长期固定，然后采用上述3种方法染色后观察小麦小孢子发育进程，发现I2-KI染色法指示淀粉积累情况效果良好，但醋酸洋红和DAPI染色的细胞核模糊不清；接着进行了改进，将固定后样品经过70%～70%乙醇(每次30 min)置换并保存在70%乙醇中，然后再染色观察，I2-KI染色法对淀粉积累情况指示效果变化不大，醋酸洋红染色的小孢子细胞核达到可观察状态[10]，DAPI染色的细胞核依然模糊不清(内部资料未发表)，推测小麦小孢子样品固定和保存与其细胞学观察效果联系密切。为此，本试验以郑麦366和BNS366为试验材料，对比了分别采用2种固定液(固定后立即进行乙醇置换)、3种染色方法染色效果和花粉可育率统计结果的差异，为明确其小孢子发育和花粉育性检测适宜的样品固定液提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验在河南师范大学小麦试验田进行，地处黄淮麦区(东经113°54′，北纬35°19′，海拔 76.3 m)，属于暖温带大陆性气候。

1.2 试验材料

选择温敏小麦雄性不育系BNS366及其近等基因系郑麦366为供试材料，均由河南科技学院小麦中心提供。于2017年10月11日播种，条播，小区长3 m，宽1.5 m，行距0.25 m，株距 0.10 m，次年选代表型植株主茎穗进行研究。按一般大田管理方式栽培。

1.3 试验设计

试验设置FAA(50%乙醇∶冰醋酸∶福尔马林=18∶1∶1)和卡诺氏(无水乙醇∶冰醋酸= 3∶1)两种固定液处理。参照刘海英等[10]的农艺性状判断方法，配合镜检，在小孢子发育的单核期、二核期、三核期和开花期，于上午9:00- 10:00，各选10穗代表型植株主茎穗，剪去顶部与基部各6个小穗，留下中部小穗，分别置于两种固定液中， 0.034×105Pa抽真空30 min后在4 ℃条件下固定24 h，经90%—80%—70%—70%梯度置换固定液(每次置换时间均为30 min)，最后转入70%乙醇中保存备用。

1.4 细胞学观察

分别取FAA和卡诺氏固定液固定的材料，参照刘海英等[10]的方法进行I2-KI法和醋酸洋红法染色、制片、观察和花粉育性统计。DAPI与I2-KI染色法相似，不同之处在于染色过程为滴加1 mg·L-1DAPI溶液且避光条件下静置3 min左右，在Leica DMIL倒置荧光显微镜下用紫外光观察、拍照和统计，小孢子细胞核呈发白发亮状态，可育花粉判断标准同醋酸洋红染色法。

1.5 套袋自交结实率调查统计

于抽穗后开花前各随机选取10个麦穗分别套袋，成熟期按国内法[9]调查和统计自交结实率。

1.6 数据分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 不同固定液对小孢子发育进程中不同染色法染色效果的影响

2.1.1 对I2-KI法染色效果的影响

由图1可知，采用FAA固定液固定， 经I2-KI法染色后，在单核期，郑麦366小孢子(图1A)和BNS366小孢子(图1E)均能观察到一个细胞核，以BNS366的细胞核清晰度相对较高。在二核期之后，郑麦366绝大部分小孢子始终维持圆形，细胞内开始积累淀粉，并随发育进程推进，积累的淀粉逐渐增多，至开花期淀粉充满整个细胞，细胞核由于淀粉积累区域的遮挡模糊不清(二核期)，至三核期之后完全观察不到；BNS366则半数以上细胞开始出现皱缩变形，且随发育进程推进，细胞变形程度加剧，变形细胞数量增多，在二核期仅见少数细胞内有较少量淀粉积累，之后细胞内未见淀粉存在，大部分细胞难以正常进入二核期，且细胞核逐渐减小(二核期)直至消失(三核期之后)。由图2可知，与FAA固定液相比，采用卡诺氏固定液固定、I2-KI法染色后，在二核期，细胞核清晰程度略有提高，但同样由于染色区域的遮挡难以满足细胞学观察的要求；在二核期之后小孢子中I2-KI法染色区域颜色较浅，但不影响开花期对花粉育性的判断。

A～D:郑麦366; E～F:BNS366; A、E:单核期; B、F:二核期; C、G:三核期; D、H:开花期. 下同。

A-D:Zhengmai 366; E-F:BNS366; A and E:Uninucleate period; B and F:Binucleate period; C and G:Trinucleate period; D and H:Flowering period. The same in figures 2-6.

图1 FAA固定液处理下郑麦366和BNS366花粉粒的I2-KI染色结果

Fig.1 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with I2-KI when fixed with FAA

图2 诺氏固定液处理下郑麦366和BNS366花粉粒的I2-KI染色结果Fig.2 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with I2-KI when fixed with carnoys

以上结果表明，BNS366小孢子败育在单核期向二核期转变时开始。采用两种固定液固定、I2-KI染色法染色，均可以清晰地反映小孢子内淀粉积累的情况，辅助判断花粉育性，其中采用FAA固定液固定，对小孢子内淀粉积累情况的指示效果较好；但均无法清晰观察二核期之后细胞核的情况。

2.1.2 对醋酸洋红法染色效果的影响

由图3和图4可知，采用两种固定液固定，经醋酸洋红法染色后观察到的郑麦366和BNS366小孢子发育过程中细胞外形的变化和内容物积累情况与I2-KI染色法相似，细胞内容物能被醋酸洋红浅染但不适宜指示其成分。采用两种固定液固定，在郑麦366小孢子发育的不同时期，均可见到红色的细胞核，且随发育进程推进，细胞核的染色程度加重，二核期少量存在的细胞内容物对细胞核观察影响不大，三核期大量内容物与细胞核染色程度差别较小，难以同时观察到三个清晰的细胞核，开花期内容物充实，能清晰看到两个梭型精核和一个圆形营养核，在单核期和二核期采用FAA固定液固定细胞核清晰度较高，在三核期和开花期采用卡诺氏固定液固定细胞核清晰度较高；在BNS366小孢子细胞核染色程度变浅，大部分小孢子仅有一个细胞核，仅少数细胞可见两个细胞核，三核期多数小孢子内有比二核期缩小的细胞核，少数小孢子内观察不到细胞核，开花期绝大部分小孢子不能被深染，细胞核消失不见，个别小孢子内可见一个比三核期继续缩小的细胞核，两种固定液固定之间无显著差异。

图3 FAA固定液处理下郑麦366和BNS366花粉粒的醋酸洋红染色结果Fig.3 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with acetate carmine when fixed with FAA

图4 卡诺氏固定液处理下郑麦366和BNS366花粉粒的醋酸洋红染色结果Fig.4 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with acetate carmine when fixed with carnoys

以上结果表明，采用醋酸洋红染色法观察到的郑麦366和BNS366小孢子发育进程与I2-KI染色法的基本一致，其优势在于对各时期细胞核的指示效果较好。采用两种固定液固定，对不同时期发育小孢子的显微观察效果存在差异，在单核期和二核期，采用FAA固定液固定效果较好，在三核期和开花期，采用卡诺氏固定液固定效果较好。

2.1.3 对DAPI法染色效果的影响

由图5和图6可知，采用两种固定液固定，经DAPI法染色后观察到的郑麦366和BNS366小孢子发育过程中细胞外形的变化和内容物积累情况与上述两种染色法也基本一致，不同之处在于细胞内容物积累情况仅能通过略显白色区域判断。DAPI染色法观察到的细胞学变化与醋酸洋红染色法相似，但DAPI法染色后细胞核发白高亮，与细胞质略显白色背景之间形成强烈反差，细胞核清晰度明显高于醋酸洋红法。与FAA固定液固定相比，采用卡诺氏固定液固定，小孢子细胞核清晰度较低，且在二核期和三核期出现细胞质区域色调偏红的现象。这些结果表明，在与前两种染色法观察到的小孢子发育规律基本吻合的前提下，DAPI染色法比醋酸洋红染色法在清晰指示细胞核情况方面的优势更强，采用FAA固定液固定，小孢子细胞核清晰度较高，细胞图像色调正常，效果更可靠。

图5 FAA固定液处理下郑麦366和BNS366花粉粒的DAPI染色结果Fig.5 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with DAPI when fixed with FAA

图6 卡诺氏固定液处理下郑麦366和BNS366花粉粒的DAPI染色结果Fig.6 Pollens of Zhengmai 366 and BNS366 stained with DAPI when fixed with carnoys

2.2 花粉育性与自交结实率比较

在郑麦366开花期取样，分别采用两种固定液固定，经3种染色方法对花粉染色后，统计花粉育性，并与成熟期自交结实率进行比较分析。结果表明，采用FAA固定液固定，I2-KI(99.07%)和DAPI(97.47%)染色法以及采用卡诺氏固定液固定，I2-KI(95.59%)、醋酸洋红(93.43%)和DAPI染色法(94.86%)染色的花粉可育率基本一致，高于采用FAA固定液固定、醋酸洋红染色法染色的花粉可育率(72.15%)和自交结实率(70.83%)。

3 讨 论

采用I2-KI、醋酸洋红和DAPI染色法染色，均可以清楚观察到BNS366败育时期在单核期到二核期，这与贺晓敏等[7]的研究结果相一致。BNS366的近等基因系郑麦366则表现出正常可育小麦的小孢子发育细胞学特征。这表明本试验模型细胞学现象准确可靠，可以进一步开展细胞学观察效果的比较研究。

固定液成分不同，其固定效果也不同，存在引起细胞学观察效果差异的可能。FAA固定液组成成分(50%乙醇∶冰醋酸∶福尔马林=18∶1∶1)中促使材料收缩的乙醇和福尔马林的相对比例较高，对小麦小孢子内容物及细胞核等细胞学特征的高保真固定均有利。刘子涵等[8]和赵卜等[11]采用FAA固定液固定不同时期的小麦花药，I2-KI法和DAPI法染色后可分别清晰指示淀粉积累和细胞核状况，醋酸洋红染色后则由于内容物也可以被浅染，造成细胞质和细胞核反差小，导致细胞核不易观察。本试验结果显示，采用FAA固定液固定，I2-KI和DAPI染色法染色，细胞图像均清晰明了，在单核期和二核期，细胞内容物尚不丰富的条件下，醋酸洋红染色法可以较好地指示细胞核情况，在三核期之后细胞图像清晰度不理想，与前人研究结果基本一致。卡诺氏固定液组成成分(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中促使材料膨胀的冰醋酸含量较高，具有软化细胞壁的作用[12]，有助于小孢子内容物的释放，降低其对细胞核的遮挡效应。王小利等[13]和钱焕焕等[14]采用卡诺氏固定液固定小麦穗，I2-KI法淀粉染色效果基本正常，醋酸洋红法也存在细胞内大量内容物影响细胞核清晰度的现象，与FAA固定液条件下小孢子显微观察效果相似，但由于前人一般在某一种固定液条件下开展研究，难以在两种固定液之间进行比较分析，DAPI染色的细胞核模糊且在有些样品细胞质区域色调偏红，推测样品特殊性和固定液种类与这种现象的发生均可能有关，这需要在同一样品体系下，采用FAA和卡诺氏固定液经上述3种染色法染色后对小孢子发育细胞学特征进行观察和比较研究，对此目前尚未见报道。本试验条件下，与FAA固定液固定相比，采用卡诺氏固定液固定，I2-KI法染色效果较浅，但不影响对淀粉积累情况的判断，醋酸洋红法染色可以清晰显示细胞核情况，在单核期和二核期细胞核清晰度较低，但在三核期之后较高，表现出明显的优势，DAPI法染色细胞图像略模糊且色调偏红，与已有研究结果基本吻合。这表明样品固定液种类确实与小孢子显微观察效果关系密切，染色法不同，适宜采用的样品固定液不同，即使同一染色法在小麦小孢子不同发育阶段，适宜的样品固定液也不同，对于I2-KI、单核期和二核期醋酸洋红和DAPI染色法均以采用FAA固定液较适宜，对于三核期和开花期醋酸洋红染色法来说，采用卡诺氏固定液较好。

花粉育性检测结果往往需要与自交结实率进行相关性分析，以验证花粉育性检测手段的准确性[10]。本研究中，与自交结实率相比，除采用FAA固定液固定、醋酸洋红染色法染色外，采用两种固定液固定，经3种染色方法检测到的花粉可育率一致偏高。原因可能是自交结实率来自整穗统计结果，而花粉可育率统计来自穗中部第1、第2位小花，即来自强势部位强势小花，进一步改进花药取样方法可能有助于解决二者不一致的问题，对此尚需开展进一步研究。采用FAA固定液固定、醋酸洋红染色的花粉可育率较低且与自交结实率一致，可能是FAA固定液对样品的高保真固定不利于开花期小孢子细胞内容物释放，细胞核与细胞质反差较小，细胞图像清晰度较低，凡不能看清细胞核特征的花粉粒均被计为不育花粉，导致可育花粉计数偏低所致。