小麦microRNA167e的特征及表达模式分析

常亚南，王瀑童，吴玉杰，袁晓波，樊亚栋， 张 莉，王苗苗，李梦园，孟凡荣，李永春

(1.河南农业大学农学院，河南郑州 454002; 2.河南农业大学生命科学学院，河南郑州 454002)

MicroRNA(miRNA)是一类在植物中广泛存在的小RNA(21～24nt)，在植物生长发育调控和逆境胁迫响应过程中发挥重要调控功能[1-2]。近年来，随着高通量测序技术的迅速发展，大量的植物miRNA被鉴定。目前，在miRNA数据库(miRBase)中已包含了82种植物的miRNA信息，其中来源于拟南芥、水稻、玉米和小麦的miRNA分别有428、738、325和125条。在拟南芥中，一些miRNA参与了碳氮代谢的调控过程[3]；在水稻[4]和玉米[5]中，一些miRNA参与了干旱、高盐、淹水等逆境胁迫的响应过程；最近的研究显示，小麦根系中依赖于miRNA的调控途径参与了谷胱甘肽相关的氧化还原调控过程[6]。在大量被鉴定的植物miRNA中，miR167是一类植物中普遍存在的保守型miRNA，在植物发育过程中发挥重要的调控功能。比如，miR167与拟南芥的胚和根系发育调控密切相关[7-8]，在番茄中该miRNA过表达后导致了花发育异常和雌性不育[9]，在水稻中miR167具有不同的时空表达模式[10-11]，且对植物外源生长素具有特定的响应模式[12]。目前，有关小麦miR167的研究还未见报道。我们前期发现，miR167与小麦籽粒的发育调控密切相关[13]。本研究拟系统分析小麦中该miRNA的染色体定位、序列特征、时空表达特性及其对渗透胁迫的响应，为明确miR167在小麦发育调控及逆境胁迫响应过程中的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

小麦(TriticumaestivumL.)材料包括豫麦18、矮抗58和中国春3个品种，于河南农业大学农业实验基地种植。在开花期挂牌，依次剪取授粉后5、10、15、20、25、30 d的麦穗，剥取籽粒。幼苗室内培养：选取籽粒饱满小麦种子经HgCl2表面消毒7 min后用无菌水冲洗；在培养皿中培养，气候箱光照强度为240 mol·m-2·s-1，光照时间为14 h，温度为24 ℃(光照)和18 ℃(黑暗)。渗透胁迫处理方法为：将培养至二叶一心期的幼苗，用20%的PEG6000溶液进行模拟干旱胁迫处理；用150 mmol·L-1的NaCl溶液进行模拟盐胁迫处理；在胁迫处理0、0.5、1、2、6、12、24、 48 h分别剪取根系和叶片组织备用。用于进行不同组织表达特性分析的材料包括：田间种植条件下成熟籽粒，开花期的穗下节、旗叶、节间、节，以及室内培养的三叶一心期的根系和叶片组织。上述试验均设三个生物学重复，所有组织取样后均需迅速液氮速冻，然后于-80 ℃保存备用。

1.2 基因染色体定位和生物信息学分析

采用来源于小麦的miR167e序列进行小麦基因组数据库EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)比对分析，对MIR167基因进行定位并注释。利用NCBI转录组的数据库搜索TaMIR167e基因的转录序列。运用RNAfold软件(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/rna-folding-form)对pre-miR167序列的发卡结构进行预测；运用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对MIR167e基因的启动子元件进行预测。运用PASPA(http://bmi.xmu.edu.cn/paspa/interface/run_PASPA.php)对MIR167e基因的下游调控序列进行预测。采用primer 5.0软件进行引物设计，克隆TaMIR167e的上游引物为YP1669(5′-GCCCCCAATTATTCCCACCTCT-3′)，下游引物为YP1667(5′-AGTAACACCCAAGAAACCC AGATCC-3′)，基因组A特异性鉴定上游引物YP1673(5′-CTCTCTCTCTCTCTCCCTCCCTCA-3′)，基因组B特异性鉴定上游引物YP1670(5′-GACCTCCTTCCCCGCCC-3′)，与通用下游引物YP1667组合进行基因组A、B的鉴定。tae-miR167e的表达分析引物为YP0943(5′-TGAAGCTGCCAGCATGATCTGA-3′)，下游引物为全式金试剂盒提供的通用引物。定量分析采用U6为内标,引物序列为：YP1303(5′-CCTTCGGGGACATCCGATAAA-3′)和YP1304(5′-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGTGC-3′)。

1.3 RNA提取和cDNA的克隆

总RNA的提取采用Trizol法，具体的提取步骤参照TaKaRa的RNAiso Plus的说明书进行。并通过非变形琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测总RNA的完整性、质量、纯度和浓度。用于tae-miR167e基因克隆的cDNA采用试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)，用于tae-miR167e表达特性分析的cDNA采用试剂盒(TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Supermix)。合成的cDNA于 -80 ℃保存备用。以上述cDNA为模板，克隆片段经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后、DNA片段凝胶回收、纯化、连接到pMD19-T载体。利用基因组A、B特异性引物，筛选出基因组A、B和D(A、B以外的重组克隆)的单克隆，送公司测序。

1.4 表达特性分析

采用Bio-Rad CFXConnectTM荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR。反应体系为20 μL，包括cDNA模板1 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物 (10 μM)各0.4 μL，用RNase-free water补足到20 μL。每个反应3次重复。采用两步法PCR，94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。荧光定量结果用2-△△Ct法计算，用Excel 2003作图。

2 结果与分析

2.1 小麦 MIR167e基因的鉴定和序列分析

课题组前期研究中发现，tae-miR167的一个家族成员(5′- TGAAGCTGCCAGCATGATCTGA -3′)在小麦籽粒发育过程中逐渐上调表达；通过与miRBase数据库序列比对发现，该miRNA为小麦miR167家族新成员，将其命名为tae-miR167e(图1A)。利用该miRNA序列进行小麦基因组Ensembl Plants比对分析显示，ta-miR167e基因位于第5同源群染色体的短臂，将其在A、B和D基因组的3个部分同源基因分别命名为ta-miR167e-5AS、ta-miR167e-5BS和ta-miR167e-5DS；通过与NCBI转录组的序列比对、转录起始位点和加尾信号的预测分析，将ta-miR167e的3个部分同源基因进行了注释(图1B)。序列比对显示，3个部分同源基因在上游调控区域差异较大，与5AS位点相比，5BS和5DS在上游调控区域的序列一致性分别为88%和86%。通过PlantCARE软件对该基因上游 2 000 bp启动子区域分析发现，上游调控区包含有光响应相关元件(GATA-motif和G-box)、生长素响应元件(TGA-element)、分生组织特异调控元件(CCGTCC-box和CAT-box)、Myb结合位点(MBS和MRE)、种子特异调控相关顺式作用元件RY-element和脱落酸响应原件ABRE等多个调控元件。为进一步证实ta-miR167e前体的序列特征，利用特异引物YP1669和YP1667从3个小麦品种(中国春、豫麦18和矮抗58)的cDNA中扩增获得了长度约431 bp的片段(图1C)。将该片段回收、连接到T-载体、转化大肠杆菌，利用A、B和D基因组特异引物对重组克隆进行鉴定，然后进行测序分析。结果表明，在转录起始位点下游85～225 bp(豫麦18)的RNA折叠区域高度保守；但3个部分同源基因之间仍存在SNP差异(图1D)；通过RNA折叠分析显示，3个部分同源基因均能形成特定的发夹结构(图1E)。对克隆区域的序列比对发现，在所检测的3个品种间存在SNP和InDel差异，在第32和79个核苷酸位置豫麦18中分别存在2个核苷酸缺失和1个SNP差异，在第364和390位核苷酸处，矮抗58存在2个SNP差异(图1F)。

2.2 籽粒发育过程中tae-miR167e的表达模式

利用实时定量对tae-miR167e在小麦籽粒发育过程中的表达动态分析结果(图2)显示，豫麦18小麦籽粒发育过程中tae-miR167e的表达量逐渐上升，授粉后第30天时表达量最高；矮抗58小麦仅在籽粒发育后期(授粉后30 d)表现出该miRNA的迅速上调表达，表达量为籽粒发育早期的10倍左右；在中国春中，从授粉后20d起tae-miR167e的表达量也明显上调，直至籽粒发育后期仍保持较高的表达水平。总体来看，tae-miR167e在小麦籽粒发育过程中呈上调表达的趋势，这预示着该miRNA在籽粒发育过程中发挥重要调控功能；tae-miR167e的表达动态在品种间存在明显差异，在花后10～25 d期间，该miRNA的表达量在豫麦18籽粒中最高，其次是中国春，在矮抗58中表达水平最低；但在花后30 d时，在矮抗58中最高，这种表达差异可能与不同品种的籽粒发育特性有关。

A：小麦miR167家族成员的序列比对；tae-miR167a～d的基因来源于miRBase数据库中的小麦；B：TaMIR167e三个部分同源基因的基因组结果；DS：下游；C：TaMIR167e基因的cDNA扩增结果；M：DL2000；1：矮抗58；2：豫麦18；3：中国春；D：Pre-miR167基因的A、B、D序列比对；黑色实线：成熟的miR167e的序列；E：Pre-miR167e的RNA折叠的发卡结构；绿色碱基：成熟miR167e序列；F:三个品种间TaMIR167e基因克隆区域序列比对分析

A:Sequence comparison of miR167s in wheat;tae-miR167a-d was derived from wheat sequences in miRBase datebase; B:Genomic results of three partial homologous genes ofTaMIR167e; DS:Downstream; C:Results of cDNA amplification ofTaMIR167egene; M:DL2000; 1-3:Fragments amplified from the cDNA of wheat variety Aikang 58,Yumai 18 and Chinese Spring,respectively; D:Comparison of A,B and D homologous of pri-miR167e genes,and the mature miR167e sequences are highlighted with black line; E:RNA folding hairpin structure of pri-miR167e and mature miR167e sequence is highlighted with green base; F:Sequence alignment of cloned regions ofTaMIR167efrom the three varieties.

图1 小麦TaMIR167e三个部分同源基因的克隆及特征分析

Fig.1 Cloning and characterization of three homeologous genes of TaMIR167e

2.3 小麦tae-miR167e的组织表达特性

通过检测不同组织中tae-miR167e的表达特性发现(图3)，在3叶期，该miRNA在叶片和根系中表达量较高，在成熟种子中次之，开花期穗下节中表达量最低；在开花期旗叶、节间和节中的表达量在品种间差异较大。在开花期豫麦18旗叶中，tae-miR167e的表达量显著低于矮抗58和中国春，而在3叶期幼叶和开花期的节间中，该miRNA的表达量显著高于另两个品种，且在节间中的表达量最高。不同品种间该miRNA的差异表达可能与品种间发育调控的差异有关，例如，开花期矮抗58的茎和节间中该miRNA的表达水平较低，这可能与该品种植株较矮有关。总体来看，tae-miR167e在不同品种和相同品种不同组织间存在表达差异，推测其对小麦不同组织的发育有一定的调控作用。

图柱上的字母不同表示材料间差异显著(P<0.05)。图3同。

Different letters on the columns in dicate significant difference among the three materials at 0.05 level.The same in figure 3.

图2 tae-miR167e在籽粒发育过程中的表达特性分析

Fig.2 Expression patterns of tae-miR167e in developing wheat grains

图3 tae-miR167e的组织表达特性分析Fig.3 Expression characteristics of tae-miR167e in different tissues

2.4 小麦tae-miR167e对渗透胁迫的响应

在PEG6000溶液(20%)介导的模拟干旱胁迫条件下(图4A和B)，tae-miR167e在矮抗58和中国春两个品种的根系和叶片中均表现出受干旱胁迫诱导而上调表达的趋势，不过在两个品种间表达水平和动态均有较大差异。在矮抗58根系中(图4A)，tae-miR167e在受胁迫0.5 h时迅速上调表达，之后表达水平回落；而在中国春根系中，该miRNA在胁迫处理0.5 h时仅有小幅的上调表达，在胁迫处理12 h时表达水平迅速升高，之后逐渐回落。整体来看，矮抗58根系中该miRNA对干旱胁迫的响应要比中国春更快，这可能与矮抗58具有较强的抗旱能力有关。在矮抗58的叶片中(图4B)，tae-miR167e受胁迫后表达逐渐上调，胁迫处理24 h达到最高；而在中国春叶片中，该miRNA虽然也表现出一定上调表达趋势，但整体表达水平明显低于矮抗58，推测tae-miR167e在小麦干旱胁迫响应过程中发挥重要调控功能。在150 mmol·L-1NaCl盐胁迫条件下，tae-miR167e在根系中的表达水平随时间延长虽有小幅的波动，但是整体表现为受胁迫而表达下调的趋势(图4C)；从总体表达模式来看，tae-miR167e在盐胁迫和干旱胁迫过程中表现出不同的响应模式，这可能与这两种渗透胁迫过程具有不同的胁迫响应通路有关；在叶片中(图4D)，所检测两个品种tae-miR167e呈现出相似的盐胁迫诱导表达模式，即整体表现为受盐胁迫而上调表达，且在胁迫0.5 h和6 h两个时间点出现两个表达峰，胁迫处理12 h后表达水平迅速回落；tae-miR167e在矮抗58小麦叶片中的表达水平明显高于中国春，这可能与所检测两个品种间胁迫响应机制的差异有关。

A：20%PEG处理的根；B：20%PEG处理的叶；C：150 mmol·L-1NaCl处理的根系；D：150 mmol·L-1NaCl处理的叶片。

A:Roots treated with 20% PEG; B:Leaves treated with 20% PEG; C:Roots treated with 150 mmol·L-1NaCl; D:Leaves treated with 150 mmol·L-1NaCl.

图4 tae-miR167e在渗透胁迫过程中的表达模式

Fig.4 Expression patterns of tae-miR167e under osmotic stresses in wheat

3 讨 论

小麦是全球重要的粮食作物，提高小麦籽粒产量、改善加工品质是保障世界粮食安全和提高人民生活水平的重要研究方向[14]。小麦籽粒发育过程是决定小麦产量和品质的关键时期，开展小麦籽粒发育分子调控机制的研究对于小麦高产优质分子育种具有重要的意义。本课题组前期研究中，系统分析了小麦籽粒发育调控相关的miRNA，发现miR167与籽粒发育过程密切相关[13]。本研究中，进一步对小麦tae-miR167e的序列特征和表达模式进行了系统分析，结果显示，该miRNA在所检测的3个品种中的表达模式均与籽粒灌浆过程呈正相关趋势，这与大麦中的研究结果一致[15]。预示着该miRNA对小麦发育发挥重要调控功能。miR167e在灌浆过程中的表达水平在品种间存在一定的差异，在矮抗58中，花后20 d后开始上调表达，花后30 d达到最高，可能与该品种具有较高的抗逆特性有关。近年来，一些研究结果表明，miR167在植物发育的多个环节中发挥重要调控功能。例如，拟南芥的miR167表达抑制导致了晚花表型[16]，该miRNA受蓝光的诱导而上调表达[17]；水稻的miR167在花药发育过程中特异上调表达，并持续到三细胞花粉阶段[18]；另有研究发现，miR167通过调控其靶基因ARF6/8参与了龙眼(DimocarpuslonganLour)体细胞胚发育[19]、鸭茅(DactylisglomerataL.)阶段发育[20]以及烟草的开花[21]调控过程。本研究发现，小麦的tae-miR167e在成熟种子、开花期旗叶、穗下节、节间和节、三叶期叶和根中存在时空差异表达现象，且表达模式在不同品种间存在差异。通过对该miRNA基因上游调控区域的序列进行分析发现，该基因转录调控区存在一些与发育调控相关的顺式元件，比如分生组织特异的调控元件(CAT-box)和种子特异性调控元件(RY-element)等，这可能是影响该tae-miR167e出现时空表达差异的重要原因。

大量研究发现，miRNA在逆境胁迫响应过程中发挥重要功能。例如，miR1139参与了低磷胁迫的响应调控[22]，miR408与水稻的冷胁迫和干旱胁迫响应密切相关[23]。近期的研究也发现，miR167参与了多种逆境胁迫响应的调控，比如番茄的细菌胁迫[24]、橡胶树的干旱胁迫[25]及玉米的渗透胁迫[26]等。本研究发现，tae-miR167e对干旱和盐胁迫均有响应，且在根系和叶片中具有不同的响应模式，而且干旱和盐胁迫过程中该miRNA的表达模式也存在较大差异，这可能与干旱和高盐胁迫具有不同的信号通路有关。序列分析显示，在tae-miR167e基因上游调控区域存在一些与胁迫响应相关的的元件，比如茉莉酸响应元件(TGACG-motif)、脱落酸响应元件(ABRE)、和光响应元件(ATCT-motif)等，这些元件可能与该miRNA参与逆境胁迫响应密切 相关。

在植物中，miRNA的序列相对较为保守，但是由于不同物种间基因组差异较大，导致编码miRNA的基因也存在序列差异[27]。本研究发现，miR167包含多个家族成员，tae-miR167e与其他成员的编码基因间序列存在一定差异。与Ensemble数据库进行BLAST分析显示，TA-MIR167A与第5染色体群的短臂基因位点100%匹配，而TA-MIR167C与第6染色群短臂的基因位点100%匹配；TA-MIR167B和TA-MIR167D在中国春基因组中未发现完全匹配的基因位点，这可能是由于不同小麦品种间的差异所致，也可能是miRNA形成过程中存在复杂的编辑现象所致，具体原因有待进一步证实。由于miRNA家族的成员间可能存在功能互补或冗余现象，从基因组水平进行miRNA基因的敲除和miRNA功能分析存在较大困难，因此直接针对成熟miRNA进行人工miRNA过表达和STTM抑制表达分析就成为理想的分析方法[28]，关于小麦tae-miR167e的生物学功能验证分析工作仍在进 行中。