现场制备表面增强拉曼光谱基底法快速检测药片中盐酸阿米洛利的含量

黄天雄，王文明，陈万超，陆偲倩，杜一平

(上海功能性材料化学重点实验室,华东理工大学 化学与分子工程学院,上海 200237)

利尿剂是治疗高血压等疾病的常用药，其机理是作用于肾脏以增加电解质、水分排泄和增加尿量的药物，根据其作用机制可分为三大类，即环式利尿剂、噻嗪类利尿剂和保钾利尿剂[1]。盐酸阿米洛利(N-脒基-3,5-二氨基-6-氯吡嗪-2-甲酰胺)属于第三类利尿剂，其作用于肾远曲小管，促使钠、氯离子排泄而减少钾、氢离子的分泌。复方盐酸阿米洛利片主要由盐酸阿米洛利和氢氯噻嗪复方制成，兼具保钾利尿和抗高血压的作用，常被用于治疗高血压病，以及心力衰竭和肝硬化等导致的水肿和腹水。但此药物过量或者不当使用会导致低钠血症、高血钾症，以及氮质血症和高尿酸血症。因此，对于此药物的生产、使用过程需严格的定量监控。目前，盐酸阿米洛利的定量分析方法主要有高效液相色谱法[2-3]和液相色谱-质谱法[4-5]。但这些方法需要昂贵的仪器设备，且体积庞大不易携带，检测耗时较长，样品前处理过程较复杂，不适用于大量样本的快速检测。使用漫反射光谱法[6]和电化学法[7]检测盐酸阿米洛利虽然样品前处理简单，检测快速，但其抗干扰能力相对较低。因此，建立一种适用于药片中盐酸阿米洛利的简便、快速、灵敏的定量检测方法具有实际意义。

表面增强拉曼光谱(SERS)由于具有水分干扰小、检测快速、灵敏度高和能提供分子化学结构信息等优点，广泛应用于药物分析[8-9]、食品安全[10-11]、环境检测[12]等领域，而使用SERS对于盐酸阿米洛利的检测尚未发现报道。基底使用寿命短是目前SERS最主要的缺点之一，严重限制了其在实际样品检测中的应用。本文通过对银溶胶合成工艺进行优化，利用便捷的加热贴快速制备银溶胶，实现了现场合成基底用于SERS检测，无需事先购买基底，避免了基底寿命短的影响。将研发的基底用于药片中盐酸阿米洛利的定量检测，并对分析性能进行评价。本工作为药片中盐酸阿米洛利含量的测定提供了一个快速、便捷的定量检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

i-Raman拉曼光谱仪(美国B&W Tek公司)，二极管激光器，激发波长为785 nm，最大激发功率为300 mW，积分时间为10 s，配备显微拉曼检测平台(20倍物镜)；JEM-2100高分辨透射电子显微镜(日本电子株式会社)。

抗坏血酸(上海笛柏生物科技有限公司)，硝酸银(上海泰坦科技股份有限公司)，柠檬酸三钠(上海凌峰化学试剂有限公司)，盐酸阿米洛利(阿拉丁试剂公司)，罗丹明6G(R6G，阿拉丁试剂公司)，氯化钠(百灵威科技有限公司)，上述试剂均为分析纯；复方盐酸阿米洛利药片(江苏迪赛诺制药有限公司)，加热贴(大连华纳科技有限公司)。所有试剂在使用过程中均未进行再提纯。实验用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm)，由德国 Sartorius arium 611DI超纯水仪制备得到。

1.2 银溶胶的制备

在Qin等[13]的基础上改进了银溶胶的制备方法：以抗坏血酸作为还原剂，柠檬酸三钠为稳定剂，通过还原硝酸银制备银溶胶基底。称取10.7 mg抗坏血酸和59.4 mg柠檬酸三钠，用水溶解并定容至100 mL，取8 mL混合溶液于10 mL玻璃瓶(内径为18.4 mm，高度为65 mm)中。取一片加热贴，待升温至50 ℃，贴在玻璃瓶外壁，并向玻璃瓶中加入0.08 mL 0.1 mol/L的AgNO3溶液，反应15 min后，撤去加热贴，冷却得到灰色的银溶胶，避光存放待用。

1.3 样品的制备

使用水溶解10 mg的盐酸阿米洛利标准品，得到100 mg/L的盐酸阿米洛利储备液，于4 ℃保存备用。移取14个不同体积的盐酸阿米洛利储备液进行稀释，得到质量浓度分别为0.8、1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、28 mg/L 的盐酸阿米洛利标准溶液，于4 ℃保存。

取一片复方盐酸阿米洛利药片(约0.1 g)研磨，准确称取0.030 0 g的药片粉末，加适量水超声溶解后，用水定容至100 mL，溶液过 0.22 μm的聚醚砜膜，得到复方盐酸阿米洛利药片储备液。采用加标回收的方法评价检测方法的准确度：取 2 mL药片储备液和0、1、2、3 mL 20 mg/L的盐酸阿米洛利标准溶液分别混合后，用水稀释至10 mL，得到药片的待测样本，每个加标浓度配制3个样本。

1.4 SERS光谱的检测

取200 μL银溶胶至2 mL离心管，加入200 μL样品溶液和100 μL 1%的NaCl溶液，振荡，取一定量于石英玻璃片上，利用便携式拉曼光谱仪，通过将激光光斑聚焦于液滴表面来实现SERS信号的采集。样本的采集参数如下：激光波长785 nm，激光功率300 mW，物镜倍数20倍，积分时间10 s，每个样本采集5次。

2 结果与讨论

2.1 银溶胶的制备与表征

在银溶胶的制备中，实验温度控制着反应的速度并最终影响合成银纳米颗粒的形状和均一性[14-15]。本文在不同的水浴温度下合成银溶胶，以R6G为探针分子，采用在1 364 cm-1和1 511 cm-1处的特征峰强度[16]对合成的银溶胶进行SERS表征，以考察不同温度合成的银溶胶对SERS增强效果的影响。图1A为不同水浴温度下，所合成的银溶胶测得R6G的SERS强度变化趋势，图中的强度和误差棒均由3次平行SERS检测计算而得。可以看出水浴温度50 ℃下所合成银溶胶的SERS强度最高，当温度较低和较高时，SERS信号强度均有所降低。

图1 不同温度下合成的银溶胶所测得R6G在1 364 cm-1和1 511 cm-1处的SERS信号(A)，以及使用3次加热贴合成的银溶胶与水浴50℃下制备的银溶胶测得R6G的SERS信号(B)Fig.1 SERS intensities located at 1 364 cm-1 and 1 511 cm-1 of R6G determined by silver colloid synthesized at different temperatures(A), and SERS intensities of R6G determined by silver colloid synthesized by three pieces of heating pasters and at 50 ℃(B)

图2 加热贴合成的银溶胶的透射电镜图Fig.2 TEM image of silver colloid synthesized by heating paster

为了更便捷地合成银溶胶，本文采用加热贴取代水浴锅为银溶胶的热源。图1B比较了水浴方式和加热贴方式所制备基底的SERS检测光谱强度，图中a、b、c分别为使用3片同一批次加热贴制备的银溶胶检测R6G的SERS强度，50 ℃表示采用水浴锅在50 ℃下制备的基底的测定结果。图1B显示，使用3片同一批次(a、b、c)加热贴制备的银溶胶比较稳定，SERS强度相差不大，1 364 cm-1峰强度批次间的相对标准偏差(RSD)为3.0%；1 511 cm-1峰强度批次间的RSD为2.3%。但其光谱强度明显低于水浴加热方式的光强。其原因可能是水浴能提供一个恒定的温度状态，而加热贴则处于持续升温或降温过程，因此所制备的银纳米颗粒SERS增强效果不如水浴加热制备的银溶胶。此外，通过加热贴制备的银溶胶纳米颗粒粒径集中在80 nm左右(图2)，产生SERS信号的热点较少，导致SERS强度降低。但考虑到现场分析条件有限(如在野外、车间、市场、流通环节等)，加热贴即拆即用，能够快速、便捷地合成银溶胶，因此，本文采用加热贴为热源。现场制备的银溶胶在4 h内可以保持稳定，如果超过4 h则需重新制备银溶胶。

图3 盐酸阿米洛利标准品固体粉末的拉曼光谱(A)，7.15 mg/L药片储备液(B)及8 mg/L盐酸阿米洛利标准溶液(C)的SERS光谱Fig.3 Raman spectrum of amiloride hydrochloride solid powder(A)，SERS spectra of 7.15 mg/L tablet stock solution(B)and 8 mg/L amiloride hydrochloride standard(C)

2.2 盐酸阿米洛利的SERS谱图分析

使用加热贴制备的银溶胶测量了盐酸阿米洛利标准品(固体粉末)的普通拉曼光谱，以及7.15 mg/L药片储备液和8 mg/L的盐酸阿米洛利标准溶液的SERS光谱(图3)。从图中可见，三者的拉曼光谱峰一致性很好，主要谱峰可归属为742 cm-1(C—N—C伸缩振动)，1 384 cm-1(C—C伸缩振动)，1 516 cm-1(酰胺ⅡC—N伸缩振动)[17-18]。鉴于1 384 cm-1处的SERS信号强，受干扰小，因此选用其为分析峰进行后续的定量分析。

2.3 盐酸阿米洛利的定量检测

使用现制备的银溶胶对不同质量浓度(0～28 mg/L)的盐酸阿米洛利标准溶液进行检测，其SERS光谱图如图4A所示。由图可知，检测浓度低至0.8 mg/L时，仍可观察观察到较为明显的特征峰。图4B为峰强度与盐酸阿米洛利质量浓度的关系曲线，由插图可知，在0.8～8 mg/L之间质量浓度(ρ,mg/L)与1 384 cm-1处的拉曼峰强度(y)呈较好的线性关系，线性方程为：y=1 395ρ-76.40,r2=0.999 2。按空白溶液5次测定结果标准偏差的3倍，计算检出限(LOD)为0.2 mg/L。

为进一步评估本方法的可靠性，按照“1.3”进行加标回收实验，结果如表1所示。测得未加标样品浓度为1.43 mg/L，与药品标识浓度的折算浓度1.31 mg/L比较接近。3个加标水平下的回收率为104%～106%，RSD为0.35%～3.5%，表明该方法具有较理想的检测准确度和精密度，适用于药片中盐酸阿米洛利的快速检测。

图4 不同质量浓度盐酸阿米洛利的SERS谱图(A)，以及1 384 cm-1下SERS信号强度与质量浓度的关系图(B)Fig.4 SERS spectra of amiloride hydrochloride with different concentrations(A),and relationship between SERS intensity and concentration of amiloride hydrochloride at 1 384 cm-1(B) concentration of amiloride hydrochloride(a-i):28,20，10,8,4，2,1,0.8,0 mg/L

*no data

3 结 论

本文提出了快速、简便的银溶胶制备方法，以适用于现场的快速SERS检测，使用所研发的银溶胶对药片中盐酸阿米洛利进行定量分析。结果表明，在0.8～8 mg/L的质量浓度范围内具有较好的线性关系，相关系数(r2)为0.999 2，LOD为0.2 mg/L，平均加标回收率为104%～106%，RSD为0.35%～3.5%，方法具有较佳的可靠性和准确性。同时，本文提出的基底制备和使用方法快速、简便、不受基底寿命的影响，可为药物的SERS分析提供一条有效的途径，有望在药物分析中得到广泛应用。