早期大肠癌中DTL核蛋白表达及其意义

周瑾， 蔡红兵， 吴秀梅

南方医科大学中西医结合医院护理部(广东广州 510315)

大肠癌(colorectal cancer)是常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。其病因与遗传、生活方式、大肠腺瘤等关系密切[1]。DTL(denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog )为无齿E3泛素蛋白连接酶同源物，最初在视黄酸诱导分化的人胚胎肿瘤细胞系NT2中被克隆[2]。DTL参与调控多种分子的泛素化降解，进而影响细胞周期的进程、DNA损伤修复等多种生理活动[3]。在进一步研究中，DTL在在多种肿瘤组织中特异性高表达，发挥了候选癌基因的作用，包括了肝癌、胃癌、Ewing肉瘤和乳腺癌[3-7]。与大肠组织相比，DTL基因mRNA水平在大肠癌组织中明显升高，并能被miR-30a-5p抑制，参与大肠癌的发病过程[8-9]。然而，作为一个核表达蛋白，目前还没有任何研究报导其与大肠癌临床参数和预后之间的关系。在本研究中，我们通过免疫组化的方法探讨DTL核蛋白在大肠癌与大肠组织中的表达，并分析DTL蛋白核表达与大肠癌临床病理参数和预后的关系。本研究表明，DTL蛋白核表达作为不利的因素参与了大肠癌的发病过程。

1 资料与方法

1.1 一般资料 于2014年2月至2017年3月收集南方医科大学中西医结合医院139例手术I～Ⅱ期大肠腺癌和35例存档大肠石蜡组织标本。纳入标准：(1)临床资料完整；(2)符合WHO中的诊断标准；(3)患者或家属签属知情同意书。排除标准：(1)有肠道手术史；(2)有肠道疾病手术史；(3)大肠癌术后复发；(4)术前有放化疗史。患者年龄19～79岁，其中男93例，女46例。

1.2 主要试剂 免疫组化采用SP法，其试剂盒购自福建迈新公司。

1.3 免疫组化 将石蜡切片置于60℃烤箱烘烤2 h后将切片按顺序浸入二甲苯中各脱蜡。进一步在不同梯度酒精中水化2 min；将切片放入盛有柠檬酸盐抗原修复液的孵育槽中，高温高压修复2 min，室温自然冷却；进一步按照SP试剂盒进行免疫组化检测：简要地，滴加卵白素后加入d-生物素溶液，进而内源性过氧化物酶阻断剂阻断。在加入10%山羊血清封闭，室温孵育10 min后弃血清；滴加1∶100稀释DTL兔抗人抗体(美国Abcam公司)，4℃孵育过夜；滴加二抗(生物素标记的羊抗兔IgG)后滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min；PBS冲洗后滴加新鲜配制的DAB液于切片中显色，中性树胶封片，显微镜下观察染色效果。

1.4 免疫组化结果判定 免疫染色评分以胞核单独进行。每张切片DTL表达水平采用公式：胞核评分=表达强度(0：无着色；1分：弱着色；2：着色；3：强着色)+着色细胞数(0分≤10%；1分≤50%；2≤70%；3>75%)；高表达：≥4分；低表达：<4分。

1.5 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理。DTL蛋白在大肠癌与大肠组织以及其蛋白表达与临床参数相关性采用2检验。生存预后分析采用Mann WhitneyU检验，Cox模型用于评估DTL表达作为影响患者生存的独立预后因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DTL蛋白在大肠癌中核浆共表达 运用免疫组化染色检测了139例大肠癌和35例大肠组织中DTL蛋白表达。结果显示，DTL蛋白在正常大肠组织中低表达，但在大肠癌组织中，可出现低表达和高表达两种不同的情况(图1)。

A：DTL在大肠癌中高表达；B：DTL在大肠癌中低表达；C：DTL在大肠组织中低表达

图1 DTL在大肠癌和大肠组织中表达(免疫组化，×400)

2.2 DTL在大肠癌中的表达 分析139例大肠癌组织和35例正常大肠组织之间DTL蛋白高表达比率差异。数据分析显示，与正常大肠组织相比，DTL蛋白在大肠癌中表达明显升高(P<0.001)。见表1。

表1 DTL蛋白在不同大肠组织中的表达 例

2.3 DTL过表达与临床参数和预后之间相关性 虽然增加的DTL蛋白表达与大肠癌患者年龄、性别及T分期无关，见表2。但DTL蛋白表达水平与患者预后相关，其过表达明显不利于大肠癌患者的预后。结果表明，DTL表达越高，患者综合生存时间越短(P=0.014)。见图2。

表2 大肠癌DTL表达与临床特征的相关性 例

图2 DTL蛋白的表达与大肠癌患者预后的关系

2.4 DTL蛋白水平是大肠癌患者生存的独立预后因子 利用Cox模型评估DTL在大肠癌中作为独立预后因子的可能性。单变量和多变量分析结果都显示，DTL表达水平可作为判断大肠癌患者预后的独立性因素(P=0.019)。见表3。

表3 总生存期单变量和多变量的Cox回归分析

3 讨论

DTL基因，又名RAMP/DCAF2/L2DTL，编码了一个推测性730氨基酸的蛋白，包含了6个高度保守的5个WD40-重复区域，能与DDB1/CULLIN4相互作用。除此之外，DTL是CRL4底物特异的适配子，介导多聚泛素化降解CDT1和P21等，这些机理的研究表明DTL发挥了关键性的生理性角色[10-12]。对于DTL在细胞内发挥的生理机能，前期有研究报道DTL-/-纯合子小鼠胚胎在2～4周细胞死亡，且细胞核形态异常，这提示DTL对细胞增殖和生长是必需的，可能其参与染色质复制有关[13]。DTL定位在染色体1q32。在这个区域，多个肿瘤存在着高频率扩增[14]。越来越多的研究表明，DTL在一些肿瘤中高表达，包括了Ewing肉瘤[7]和胃癌[2]等。而在大肠癌中，也有相关的研究表明，与大肠黏膜相比，DTL mRNA在大肠癌中表达明显升高，这提示DTL在大肠癌发病过程中发挥了重要作用。然而，其蛋白在大肠中的表达与临床参数和预后的关系尚未见报道。

DTL是泛素连接酶CRL4的一种底物接头蛋白。CRL4泛素连接酶是公认的细胞周期调节关键蛋白，在有丝分裂和S期过程中具有重要作用。CRL4-DTL可以促进细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p21发生泛素化降解，进而调控细胞的死亡[15]。在本研究中，我们首先观察到，DTL是一个核表达为主的蛋白。与大肠组织相比，DTL蛋白在大肠癌中表达明显上调。该结果与外国学者分别在乳腺癌[6]、Ewing肉瘤[7]和胃癌[2]等肿瘤结果相似，同时也验证了Baraniskin等[8]报道DTL mRNA水平在大肠癌中表达升高的可靠性。为了明确DTL蛋白表达与大肠癌临床进展之间的关系，我们统计分析了DTL蛋白表达与大肠癌临床病理参数的相关性。结果显示，虽然增高的DTL表达与大肠癌的发病年龄、性别及T分期无关，该结果类似于Baraniskin等[8]的研究，提示DTL高表达与大肠癌的增殖关系不是很明确。

在以往的研究[3-4，6-7]中，DTL高表达作为不利的预后因子参与了多种肿瘤的发病过程。我们分析了DTL蛋白在大肠癌中的高表达与临床预后的关系。结果显示，DTL的表达与大肠癌的预后呈明显负相关。DTL蛋白表达越高，大肠癌患者综合生存时间越短，反之，DTL表达越低，患者综合生存时间越长。该数据与其在胃癌[2]和Ewing肉瘤[7]相一致，提示DTL高表达是大肠癌预后不良的重要因素。最后，我们单变量和多变量分析发现，DTL表达可以作为评估大肠癌预后的一个独立影响因子。

总之，我们研究发现DTL蛋白在大肠癌中表达上调，其促进了大肠癌临床进展，并可作为大肠癌一个独立不良预后因子。结果提示DTL是大肠癌预后判断的一个重要分子标志，其亦可能作为大肠癌分子治疗靶标。本研究结果为后续相关研究提供了一定的前期基础和理论支持。