雷公藤内酯醇对类风湿关节炎髓源性抑制细胞的作用*

何敏， 彭桉平， 徐宁， 吴炜霖， 王云秀， 何晓红， 黄宪章， 柯培锋△

广东省中医院 1检验医学部， 2风湿科(广东广州 510120)

髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群异质性的、具有免疫调控功能的细胞群体。在肿瘤研究领域，因MDSCs有抑制功能可引起肿瘤逃逸而被广泛研究[1-2]。近年来MDSCs的研究逐步拓展到自身免疫疾病领域。在多种自身免疫性疾病的动物模型中发现MDSCs大量聚集，并参与炎症免疫应答，其作用逐步得到重视。有意思的是不同于肿瘤相关的MDSCs，多项研究认为自身免疫疾病相关MDSCs有促炎作用，可促进疾病的发展[3]。这些结果表明MDSCs的功能会受到免疫微环境的影响而发生改变，是一群可塑性很强的免疫细胞，在细胞免疫治疗中有可能发挥重要的作用。雷公藤在临床上广泛应用于抗炎、抗免疫排斥及自身免疫病的治疗，具有抗炎和免疫调控双重功效。雷公藤内酯醇(triptolide，TPT)是雷公藤的主要活性单体，研究表明TPT对多种免疫细胞，如单核/巨噬细胞、Th17细胞等都具有重要的调控作用，然而TPT能否调控MDSCs的分化和功能尚鲜见报道。本研究采用流式细胞术检测了类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者循环MDSCs的比例，分析其与疾病活动度的相关性；进而观察TPT对RA患者中MDSCs比例和MDSCs分泌的主要产物关键功能因子精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)的影响，为TPT抗RA治疗提供新的视角和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和药物 淋巴细胞分离液购自Axis-Shild PoCAS公司；细胞培养试剂和TRIzol购自Invitrogen公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Ameresco公司；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)购自R&D systmen；抗人CD33、HLA-DR和CD11b等流式抗体购自BD Bioscience公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司；荧光定量PCR试剂盒购自Promega公司；引物由Takara公司合成；鼠抗人Arg-1抗体购自Cell Signaling Technology公司；兔抗人GAPDH抗体购自Abcam公司；TPT(纯度为99.78%)购自Sigma。TPT用DMSO溶解，使用前用细胞培养液稀释至工作浓度，DMSO的终浓度低于0.01%。

1.1.2 研究对象 选择2018年1—6月于广东省中医院就诊的RA患者25例(RA患者组)。其中，男7例，女18例，年龄21～73岁，平均(50.84±14.51)岁。根据肿胀关节数、压痛关节数、C反应蛋白、红细胞沉降率等临床检测指标，计算DAS28评分，分为两组：活动组(n=15)和稳定组(n=10)。RA的诊断符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟推荐的RA分类标准，所有患者近半年均未使用免疫调节药物。另选15名健康志愿者作为健康对照组，男5例，女10例，年龄21～69岁，平均(43.47±13.86)岁，无肿瘤及自身免疫疾病病史。本研究通过广东省中医院医学伦理学委员会批准，所有患者和志愿者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞(PBMC)的分离和培养 收集RA患者和健康人外周静脉血，乙二胺四乙酸(EDTA)钠盐抗凝。采用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离出PBMC。加入含10%人胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。分别加入0、1、5、10 nmol/L的TPT，48 h以后流式细胞术检测MDSCs占单个核细胞的比例。

1.2.2 MDSCs的分离与培养 PBMC用流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)洗液50 μL重悬，加入CD11b和CD33抗体10 μL/106细胞，4℃避光孵育30 min，洗涤2次，重悬于FACS液中。采用贝克曼库尔特MofloAstrios EQ流式细胞分选仪，分选CD33+CD11b+细胞，收集于RPMI RPMI-1640培养基中。

分选后的MDSCs于96孔细胞培养板中培养，mTesR-1细胞培养基加入GM-CSF (20 ng/mL)培养，根据实验情况分别加入0、1、5、10 nmol/L的TPT干预，48 h后收集细胞，分别提取RNA和蛋白用于检测Arg-1的mRNA和蛋白表达水平。

1.2.3 流式细胞术检测MDSCs细胞比例 细胞表面染色按照常规染色方法进行操作。收集各组细胞，制备100 μL细胞悬液，加入抗人PE-CD11b抗体，抗人FITC-CD33抗体，抗人APC-HLA-DR抗体进行染色，4℃避光孵育30 min，洗涤2次，重悬后采用BD Canto Ⅱ流式细胞仪检测，FACS Diva7.0软件分析流式检测结果。

1.2.4 qRT-PCR检测Arg-1 mRNA表达水平 按照TRIzol试剂说明书操作提取细胞总RNA，用微量核酸定量仪Nanodrop2000c测定RNA和纯度和浓度，提取后的RNA置于-80℃冰箱中保存。取1 μg RNA于42℃逆转录，以GAPDH为内源对照，进行荧光定量PCR，检测Arg-1的mRNA表达水平。PCR程序为95℃预变性10 min，95℃10 s，60℃ 30，扩增40个循环。反应结束后确认定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，结果以目的基因与相应的GAPDH比值表示。引物序列如下：Arg-1：上游引物：5′- CTGGCAAGGTGGCAGAAGTC-3′，下游引物：5′- ATGGCCAGAGATGCTTCCAA-3′；GAPDH 上游引物：5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′， 下游引物：5′-GTCATGAGTCCTTCCACGATACCA-3′。

1.2.5 Western blot检测Arg-1蛋白 Western blot检测Arg-1蛋白水平的变化：MDSCs经不同浓度的TPT作用48 h后，收集各组细胞，加入蛋白抽提裂解液抽提细胞总蛋白，冰浴15 min，离心收集细胞总蛋白。蛋白提取物经考马斯亮蓝法定量后，30 μg上样至8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳，常规转膜；后者经5%脱脂奶粉封闭后，分别与1∶1 000稀释度的相应一抗(抗Arg-1抗体、抗GAPDH抗体)和适宜稀释度的二抗(羊抗鼠/兔Ig-HRP)孵育1 h，PBST洗膜。最后用ECL显色系统显色，显影和定影。

2 结果

2.1 RA患者外周血MDSCs的频率升高 流式细胞术检测结果显示：RA患者组与健康对照组外周血MDSCs(CD11b+HLA-DR-CD33+)比例差异有统计学意义(P<0.05)。活动组MDSCs占PBMC比例为(5.32±2.49)%，明显高于稳定组(2.33±1.26)%和健康对照组(1.78±0.68)%，见图1。

2.2 RA患者外周血中Arg-1的表达水平升高 RA患者组的Arg-1较健康对照组明显升高，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 TPT下调RA患者外周血中MDSCs水平 TPT从5 nmol/L浓度开始就能够下调MDSCs的细胞水平(P<0.05)。且随浓度升高，抑制作用增强，见图3。

2.4 TPT抑制MDSCs Arg-1的表达 TPT能够呈剂量依赖性地下调RA患者MDSCs中Arg-1的mRNA和蛋白表达水平，见图4。

3 讨论

RA是一种慢性、进行性的自身免疫疾病，其发病率和致残率高，严重危害人类健康。虽然发病机制尚未明确，研究表明免疫异常致使机体自身耐受破坏在RA发病过程中起着关键作用。MDSCs是一群来自于骨髓的非成熟细胞，最早于1987年在荷瘤小鼠中发现，在肿瘤发生时发生大量聚集、扩增，并可以抑制肿瘤免疫逃逸。近年来在自身免疫性疾病中的作用被重新认识，认为其有可能参与了自身免疫病的病理进程(Ref)。Yi等[4]从实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)动物模型发现，虽然分离出的MDSC能抑制T细胞增殖，但却可以在IL-6和TGF-β协同作用下促进Th17细胞分化，用吉他西滨选择性剔除MDSCs后Th17细胞减少。King等[5]的结果也表明内源性的MDSCs并不能抑制自身免疫性疾病的进展，甚至会加重病情。尽管不同研究得出的结论可能与所关注的细胞亚群和所处的炎症环境不同有关，但是这些结果提示MDSCs有可能是一把“双刃剑”，其功能会受到环境的影响，在不同疾病中发挥促炎或者抑炎的功能。

A:流式细胞术结果；B:各组MDSCs占PBMC比例；*P<0.05

*P<0.05

*与0 nmol/L比较P<0.05

A:Arg-1 mRNA; B:Arg-1蛋白;*P<0.01

MDSCs的募集、扩增和活化是其发挥免疫抑制功能的必要条件。为了探讨MDSCs与RA之间的相互关系，我们首先用流式细胞术检测了RA患者外周血中的MDSCs(CD33+CD11b+HLA-DR-)比例，发现RA患者活动期外周血MDSCs细胞比例不仅明显高于健康对照组，而且高于疾病非活动组，这与Guo等[6]的结果一致，提示MDSCs有可能参与了RA的发病机制。体外实验进一步表明5 nmol/L 浓度的TPT即可下调MDSCs的比例，且呈现剂量依赖性。MDSCs有望成为TPT抗RA免疫治疗的靶点。

MDSCs可以通过多种机制发挥其免疫调控作用，其中最直接的效应是调节L-精氨酸代谢。MDSCs可以通过表达高水平的Arg-1，催化L-精氨酸代谢为L-鸟氨酸和尿素，从而大量消耗环境中的L-精氨酸，影响T细胞的增殖和活化[7]。与正常对照组相比，RA患者PBMC中的Arg-1表达水平明显升高，约为对照组的2.5倍，其变化趋势与外周血中的MDSCs比例一致。这些结果提示，在RA患者体内，Arg-1是MDSCs一个非常重要的效应分子。

接下来我们应用流式细胞仪分选纯化MDSCs，并评价TPT对Arg-1表达的影响。结果表明：TPT能够呈剂量依赖性的抑制Arg-1 mRNA和蛋白的表达(图4)。尽管Arg-1在抑制T细胞增殖等方面有调控作用[8]，新近文献表明MDSCs及其产生的Arg-1中在自身免疫性疾病有可能有致病性。Wu等[9]在SLE患者和人源化小鼠中发现，MDSCs通过Arg-1通路，促进Th17细胞的分化。在小鼠MS模型中，加入Arg-1的抑制剂NOHA能够缓解疾病[10]。但是TPT能否通过调控MDSCs的Arg-1通路，进而影响Th17等细胞的分化，还有待更进一步的研究。

综上所述，本研究发现RA患者循环MDSCs比例升高，且表达功能分子Arg-1。加入TPT干预以后，可以有效抑制Arg-1的mRNA和蛋白水平，表明TPT不仅能调控MDSCs的分化，还能改变它的功能。这些结果提示MDSCs有可能是TPT作用的靶细胞，基于MDSCs和Arg-1的免疫有望成为RA等自身免疫性疾病的治疗策略。