银杏内酯B抗心肌氧化应激损伤作用机制研究❋

苏 琦，赵 娜，苗雨欣，李朝阳，肖 童，孙雅涵，何玛丽，田 炜，徐菁蔓△

(1.华北理工大学医学实验研究中心，河北 唐山 063210； 2.华北理工大学实验动物中心，河北 唐山 063210； 3.国家科技部老年医学国际科技合作基地，河北 唐山 063210)

心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌在恢复血流之后发生的更加严重的损伤，常出现梗死面积扩大和心率失常[1]。氧化应激(oxidative stress，OS)是机体受到多种有害因素刺激后，活性氧簇(ROS)产生过多，抗氧化能力下降对机体造成损伤。在MIRI中ROS大大增加，造成病理损伤[2]。近年来,磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号途径已成为研究热点，Akt对下游信号分子的活化起重要作用，如糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)[3]，GSK-3β磷酸化失活对于抗氧化应激损伤尤为重要，故本实验以此作为研究方向。

银杏内酯B(ginkgolide B，GB)是银杏叶(ginkgo biloba L)提取物。银杏叶化学成分丰富，其主要有效成分为萜内酯类化合物，包括银杏内酯A、B、C等[4]，其中GB生理活性最强[5]。研究发现，GB可以用于治疗心血管疾病，具有抗炎、抗氧化等作用[6]，但在MIRI方面研究甚少。本实验意在探讨GB能否具有发挥抗氧化应激损伤的作用及其作用机制，以期为MIRI临床治疗提供方向。

1 材料与方法

1.1 细胞株

H9c2细胞株(来源于大鼠胚胎心脏组织)购自美国ATCC 公司。

1.2 试剂与仪器

实验药物银杏内酯B(Ginkgolide B GB)由北京百威灵科技有限公司提供(纯度>99%)；H2O2(批号STBB6350)购自美国Sigma 公司；兔源单克隆抗体p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)、鼠源微管蛋白β-Tubulin(多克隆抗体)及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司；荧光染料罗丹明123(Rhodamine 123)购自上海碧云天生物技术研究所，改良Eagle 培养基(dulbecco'smodified eagle medium DMEM)，四甲基偶氮唑盐比色法[3-(4、5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT] 细胞增殖及毒性检测试剂盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(Butyleyanoacrylate，BCA)蛋白浓度检测试剂盒、电化学发光免疫分析(ElectrogeneratedChemiluminescence，ECL)发光检测试剂盒，均购自上海碧云天生物技术研究所，37 ℃二氧化碳CO2 培养箱购自美国Thermo Forma 公司；荧光酶标仪购自美国Molecular Devices公司；生物安全柜购自新加坡ESCO 公司；5804R 高速冷冻离心机购自德国Eppendorf 公司；JY200C 电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司；酶标仪和湿转运系统购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细胞培养 从液氮罐中取出冻存的H9c2细胞，放入37 ℃恒温水浴箱中溶化，在超净工作台中将溶好的细胞悬液移入装有5 mlDMEM培养基(含10%胎牛血清、双抗)的无菌离心管中，置于离心机离心(1000 rm，离心5 min)后弃上清，将细胞重悬于25 ml培养瓶中，并使其均匀分布，放置于细胞培养箱(CO2浓度为5%，温度为37 ℃，饱和湿度)中进行培养；在培养24～48 h之后显微镜观察H9c2细胞状态，待其长至大约>90%时，选择状态良好的H9c2细胞弃培养基，用无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline， PBS)将细胞冲洗3遍，用0.25%胰蛋白酶200 μL 消化2 min，用10 ml培养基终止消化，反复轻轻吹打为均匀的细胞悬液，分配到2个培养瓶中即可，每周传代2～3次；选取生长状态良好的细胞，在处于对数生长期且细胞数目达到80%～90%时同传代步骤相同，将细胞消化离心后加入500 μL冻存液，使其悬浮充分混匀后移入1.5 ml冻存管中，用封口膜封口并标记，保存于-80 ℃冰箱中(如需长期保存转入液氮罐中)。

1.3.2 实验分组及处理条件 实验共分为4组。Control组：正常培养的H9c2细胞不进行任何药物处理；H2O2组：650 μmol/L 处理20 min；GB+H2O2组：加入不同浓度GB(15.0、30.0、60.0 和120.0 μmol/L)处理20 min，加入H2O2650 μmol/L处理20 min；之后的研究中GB+H2O2组均采用60.0 μmol/L预处理20 min，然后用650 μmol/L处理20 min， GB组：只加入60.0 μmol/L的GB处理20 min。

1.3.3 MTT 法检测细胞存活率 选取对数生长期且细胞状态良好的细胞重复培养步骤，待其消化离心重新悬浮后进行细胞计数，稀释为1×104个/ml，96 孔板加入100 μL/孔，约1000个细胞培养24～48 h，待其长到75%左右后按照各组要求加药处理细胞，处理后把液体全部吸出，PBS冲洗，重新加入完全培养基100 μL，再加入10 μL MTT，继续在细胞培养箱内培养4 h后，加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，放置于摇床慢摇15 min后，在显微镜下观察到蓝色结晶物完全溶解，用酶标仪在570 nm 处测定每孔吸光度值(optical delnsity，OD)，计算细胞的存活率(survival rate，SR)。细胞存活率%=实验组OD值/ 对照组OD值×100%。

1.3.4 检测线粒体膜电位 选取对数生长期且细胞状态良好的细胞重复细胞培养步骤，待其消化离心重新悬浮后进行细胞计数，稀释为1×104个/ml，96 孔板加入100 μL/孔，约1000个细胞，培养24 h长至75%左右后按照各组要求处理细胞，处理后把培养基全部吸出，PBS冲洗2遍，重新加入含有2 μmol/l R123的培养基100 μL培养40 min后，倒掉其中培养基，PBS洗2遍，再加入100 μL完全培养基，用酶标仪在507～529 nm处检测定每孔吸光度值。

1.3.5 Western blot 检测 Akt 和 GSK-3β 磷酸化蛋白表达 在2 ml小皿中细胞培养48 h后，选择生长状态良好的细胞按照分组处理再弃培养基，PBS冲洗3遍，加入40 μL裂解液冰上裂解30 min, 将细胞收集于Eppendorf 管中,超声破碎15 s,4℃ 12 000 r/min，离心15 min 后取上清液，使用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法进行蛋白定量。以25μg/孔上样，依次进行电泳及转膜，使用10%脱脂奶粉室温慢摇2 h,孵育p-Akt(Ser473)、p-GSK-3β(Ser9)及β-Tublin一抗(1∶1000稀释),4 ℃慢摇过夜(8～12 h)，Tris-HCl 缓冲盐溶液洗3次，每次10 min；二抗(1∶1000稀释)室温慢摇孵育2 h，Tris-HCl 缓冲盐溶液洗3次，每次10 min；增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)荧光显色，用Image J 进行灰度扫描及定量分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 GB对心肌氧化应激损伤的影响

2.1.1 GB对细胞存活率的影响 表1显示，与对照组比较， H2O2组的细胞存活率下降。不同浓度的GB预处理，MTT检测OD值均升高，其中GB为60 μmol/L 时效果最为明显，差异有统计学意义，表明GB能减轻H2O2引起的细胞存活率下降，60 μmol/L为其最适浓度。

表1 MTT法测定GB对H9c2细胞存活率的影响

注：与control组比较:*P<0.05;与H2O2组比较:**P<0.05

2.1.2 GB对心肌细胞线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)开放的影响 表2显示，与对照组比较， H2O2组的荧光强度下降。60 μmol/L 的GB预处理，荧光酶标仪检测荧光强度升高，差异有统计学意义，表明GB能够减轻H2O2引起的mPTP开放。

表2 荧光酶标仪检测GB对H9c2线粒体膜电位的影响

注：与control组比较：*P<0.05;与H2O2组比较：**P<0.05

2.1.3 GB对Akt磷酸化蛋白表达的影响 图1显示，与对照组比较， H2O2组的Akt蛋白磷酸化水平降低， GB预处理组中Akt蛋白磷酸化水平增强，差异有统计学意义(P<0.05)，表明GB能够上调Akt蛋白磷酸化水平。

注：与control组比较：*P<0.05;与H2O2组比较：**P<0.05图1 P-Akt (Ser473)蛋白表达比较

2.1.4 GB对GSK-3β磷酸化蛋白表达的影响 图2显示，与对照组比较， H2O2组的GSK-3β蛋白磷酸化水平降低，GB预处理组中GSK-3β蛋白磷酸化水平增强，差异有统计学意义(P<0.05)，表明GB能够上调GSK-3β蛋白磷酸化水平。

注：与control组比较：*P<0.05;与H2O2组比较：**P<0.05图2 p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达比较

3 讨论

GB作为银杏叶中活性最强的成分，曾被称为 “活化石”，具有极高的观赏、经济和药用价值，化学成分极为丰富。有研究发现，GB在抗脑缺血/再灌注损伤中可发挥保护作用，明显减轻大脑损伤[7]， 还可降低氧化应激所导致的内皮细胞损伤[8]。近年来相关研究显示，GB在I/R损伤方面可发挥其保护作用，降低损伤程度[9]。从本研究MTT检测结果可以看出，GB能够明显减轻氧化应激损伤，提高H9c2细胞存活率。

线粒体是机体各种生命活动的能量来源，在维持机体正常代谢中扮演着重要角色。而mPTP是一种位于线粒体内、外膜之间的膜通透性转换孔，在正常情况下mPTP处于关闭状态，阻挡离子和其他代谢物质通过[10]。但当各种有害因素刺激细胞时，如H2O2会导致线粒体钙超载和氧化应激程度增加，线粒体膜及电子传递链发生氧化损伤， ATP 产生大大减少，线粒体稳定状态被破坏，从而产生大量ROS[11]，使细胞发生应激性损伤，没有足够的ATP就会使mPTP处于开放状态[12]，大量本被阻挡在线粒体外的分子、离子涌入线粒体内，导致损伤引发细胞凋亡。近年来发现，若能抑制mPTP开放，就有可能降低细胞氧化应激损伤[13]。本研究荧光酶标仪检测结果表明，银杏内酯B能够抑制mPTP 开放，发挥抗氧化应激损伤作用，这表明银杏内酯B也可通过线粒体机制发挥心肌保护作用。

PI3K/AKT信号通路是细胞内非常重要的信号传导通路之一，可以在机体多种生命活动过程中影响下游效应分子(一氧化氮合酶、Bcl-2 家族、胱天蛋白酶9(caspase-9)等)的活化状态，从而发挥抗凋亡、减轻细胞损伤的作用。由于AKT磷酸化之后可产生级联放大效应，因此若采用阻断此通路中关键环节的方法，就可能有效防治I/R损伤及细胞凋亡等[14]。目前已有研究显示，通过药物靶向治疗Akt通路的关键环节，可明显减轻心肌损伤和细胞凋亡[15]。本研究结果显示，GB能够使Akt磷酸化蛋白表达明显增加，提示GB可能是通过PI3K/Akt通路发挥抗心肌细胞氧化损伤作用。

GSK-3β是GSK-3亚型之一，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，具有重要的细胞调节功能，广泛分布于哺乳动物真核细胞中[16]。在正常状态下GSK-3β处于激活状态，当其被磷酸化后则失活，若能抑制GSK-3β活性就可提高心肌细胞抗氧化应激能力。近年来各项研究表明，GSK-3β与I/R损伤等心血管疾病密切相关[17]，同时也是参与肝糖代谢的关键酶，广泛参与体内多种功能活动的调节。GSK-3β也与细胞凋亡、损伤等紧密关联，主要是通过磷酸化多种底物蛋白来调节糖原的合成代谢，参与细胞的分化、增殖等[18]。有研究认为，GSK-3β是心肌保护通路的一个重要交点，GSK-3β磷酸化在上游信号AKT作用下增强，从而减轻MIRI。本研究结果显示，GB能够上调GSK-3β磷酸化蛋白的表达，提示GB可能是通过此途径发挥心肌保护作用的。

本实验结果表明，GB预处理可以使H9c2细胞存活率升高，并提示 GB可能是通过PI3K/Akt 途径抑制GSK-3β活性, 减少mPTP 开放，从而减轻氧化应激引起的心肌细胞损伤。