62份非PK型紫苏种质的挥发油GC-MS分析和新化学型发现△

郭佳琪，李卫萍，沈奇，杨森，商志伟，郭宝林*，葛菲*

1.江西中医药大学，江西 南昌 330006；2.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193；3.贵州省油菜研究所，贵州 贵阳 550008

1 材料

1.1 仪器和试剂

GC-MS(ULTRA-ISQ)气相质谱联用仪器(Trace 1310，赛默飞世尔科技公司)；旋转蒸发仪(N-1001，上海爱朗仪器有限公司)；分析天平(FA2014N型，上海精密科学仪器有限公司)；循环式真空泵(CA-1111，上海爱朗仪器有限公司)；冷却水循环装置(CA-1111型，上海爱朗仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ-500E型，昆山市超声仪器有限公司)。

石油醚(分析纯，北京化工厂)；正己烷(色谱纯，赛默飞世尔科技公司)；无水乙醇(分析纯，北京化工厂)；水为蒸馏水。

1.2 样品来源

将收集到的800余份国内不同来源的紫苏种质的种子于2017年种植于贵州省长顺县，在紫苏营养生长后期主要通过叶片气味进行筛选，排除具有典型PK型紫苏所特有的气味类型的材料，选出62份紫苏种质，并在穗前期采收紫苏叶，将叶材料净选、阴干备用。样品信息见表1。

表1 紫苏样品信息

2 方法

2.1 挥发油提取

紫苏叶粉碎后过四号筛，准确称取紫苏叶粉末50 g于圆底烧瓶中，加入蒸馏水500 mL，采用水蒸气蒸馏法提取5 h，用20 mL石油醚萃取2次，加适量无水硫酸钠干燥12 h，过滤后40 ℃回收石油醚，精密吸取挥发油1 μL，用正己烷定容至5 mL，备用。

2.2 GC-MS分析

色谱条件：HP-5MS 色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为氦气，进样口温度200 ℃。程序升温：起始温度50 ℃，10 ℃·min-1升至100℃，保留3 min，5 ℃·min-1升至200 ℃，保留3 min。分流比20∶1，进样1 μL。

质谱条件：离子源为EI，70 eV，接口温度250 ℃，质量扫描范围m/z50～500，溶剂延迟时间3 min。

3 结果

3.1 挥发油提取率和成分鉴定

62份紫苏叶样品挥发油提取率为0.02%～2.00%，其中以样品M544的挥发油得率最高，样品M626的得率最低。采用GC-MS对62份紫苏叶挥发油样品进行分析，通过数据库NIST 2.0进行检索并核对文献资料，共鉴定了D-柠檬烯(D-Limonene)、芳樟醇(Linalool)、紫苏烯(Perillene)、紫苏酮、(-)-胡椒酮[(-)-Piperitone]、紫苏醛(Perillaldehyde)、紫苏醇(Perillylalcohol)、异紫苏酮(Isoegomaketone)、石竹烯(Caryophyllene)、葎草烯(Humulene)、(Z，E)α-法尼烯[(Z，E)α-Farnesene]、肉豆蔻醚(Myristicin)、榄香素(Elemicin)、(-)-斯巴醇[(-)-Spathulenol]、氧化石竹烯(Caryophyllene oxide)、植醇(Phytol)、β-细辛脑(β-Asarone)、芹菜脑(Apiol)等30多个化合物，以面积归一化法得到各成分的相对百分含量。具体参见表2～3。

3.2 样品化学型分类

根据主要成分类型和相对含量确定化学型，本项结果呈现出十分多样的化学型类型。

采用RevMan 5.1软件进行Meta‐分析。计数资料用比值比（OR）为效应指标，各效应量均给出其点估计值和95%可信区间（95%CI）。采用χ2检验分析各研究结果间的异质性，当P≥0.10，I2≤50%时，采用固定效应模型进行Meta‐分析；反之，则采用随机效应模型进行Meta‐分析，并谨慎解释研究结果。若数据无法合并则行描述性分析。对纳入研究数＞10个的结局指标采用漏斗图分析发表偏倚。

3.2.1 单一主成分构成类型

3.2.1.1 PA型 PA型的紫苏挥发油构成以紫苏醛为主要单萜，紫苏醛质量分数一般在45%以上，一般含有较高的D-柠檬烯，但低于紫苏醛[4，11]，有时含少量紫苏醇及紫苏酮。PA型是仅次于PK型的常见单萜化学型，本次实验有38份PA型样品。发现一种新类型，即样品M502的挥发油中D-柠檬烯相对质量分数高达39.51%，而紫苏醛相对质量分数为29.78%，是一种新的亚型，建议命名为PA-Ⅱ型。剩余37份样品中几个主成分的质量分数分别为：紫苏醛42.16%～80.50%，D-柠檬烯0～18.55%，紫苏醇0～3.37%，紫苏酮0～6.92%。

3.2.1.2 PL型 PL型的成分构成特点为以紫苏烯为主要单萜[4，11]，质量分数一般在50%以上，且含有少量反式柠檬醛和紫苏酮。该类化学型为少见类型本次有2份样品(M068、M267)为该型，其中紫苏烯相对质量分数分别为71.65%、57.78%，紫苏酮相对质量分数分别为2.04%、1.28%，未检出反式柠檬醛。

3.2.1.3 PT型 PT型的成分构成特点为，以胡椒烯酮(Piperitenone)为主要单萜[4，11]，其相对质量分数一般在50%以上，同时也含有较多的D-柠檬烯、少量的(-)-胡椒酮及紫苏醛，该类型是少见类型。本次有3份样品(M082、M386、M398)，含有较高的(-)-胡椒酮，相对质量分数为59.91%～62.37%，同时含有D-柠檬烯6.75%～17.56%和紫苏醛1.24%～2.79%，并且不含有胡椒烯酮，与Zhang等[12]归类为DLP型紫苏的挥发油组成特点一致，从化合物次生代谢过程来看，胡椒烯酮和胡椒酮为同一个途径的化合物，具有直接转化关系[5]，本研究将该种化学型命名为PT-Ⅱ型的建议更为合理。

3.2.1.4 PP型 PP型指的是以芳香化合物为主要构成成分的化学型，单萜类成分含量很低，但倍半萜类成分含量常较单萜化学型高，常见石竹烯相对质量分数超过20%[11]。PP型又细分为：PP-a型，其主要成分芹菜脑，相对质量分数50%以上；PP-s型，主要成分β-细辛脑，相对质量分数40%以上；PP-m型，主要成分肉豆蔻醚，相对质量分数70%以上；如两种及以上成分兼有则定义为PP-am、PP-em、PP-emd(e代表榄香素)等。本次样品中，有3份PP-a型(M046、M100、M516)，芹菜脑相对质量分数分别为55.01%、56.97%、82.97%，石竹烯相对质量分数分别为24.28%、27.61%、8.68%，其中M516较为特殊；1份PP-s型(M292)，β-细辛脑的相对质量分数为40.12%，石竹烯相对质量分数22.65%；4份PP-m型(M438、M544、M550、M955)，M550较为特殊，肉豆蔻醚质量分数为43.66%，石竹烯20.00%，同时含有紫苏酮13.04%。另外3份种质中肉豆蔻醚相对质量分数为66.99%～74.04%，石竹烯相对质量分数为15.22%～25.57%。

3.2.1.5 PS型 本研究首次发现倍半萜成分含量很高的样品2份(M444、M615)，建议命名为PS型(S为sesquiterpene简写)，初步规定该化学型的特点为某倍半萜类成分质量分数高于30%，且其他特征性成分(单萜或芳香化合物)质量分数低于15%。M444中倍半萜类化合物氧化石竹烯的相对质量分数高达46.47%，命名为PS-c型；M615中倍半萜类化合物(Z，E)α-法尼烯相对质量分数30.64%，命名为PS-f型。

表2 PA型紫苏叶样品挥发油得率及成分相对含量 %

续表2

注：—表示质量分数小于0.1%；*为新发现化学型。

表3 几种化学型紫苏叶样品挥发油得率及成分相对含量 %

续表3

注：—表示质量分数小于0.1%；*为新发现化学型。

3.2.2 混合化学型 兼有两个化学型特点的为混合化学型，一般两个主成分的相对质量分数比例为2∶1～1∶2。

3.2.2.1 PAPK型 兼有PA型和PK型两种化学型的特点，迄今仅在中国的种质中发现[12]，本次发现3份样品(M190、M548、M574)，分别含紫苏醛16.8%、17.97%、24.90%，紫苏酮34.66%、31.71%、14.52%，这3份种质的倍半萜成分含量均较高，石竹烯质量分数分别为20.26%、15.81%、15.91%。

3.2.2.2 PAPT型 兼有PA型和PT型两种化学型的特点，为本次新发现类型，1份样品(M260)，含有紫苏醛22.29%、(-)-胡椒酮40.98%、D-柠檬烯14.74%。

3.2.2.3 PAPP型 兼有PA型和PP型两种化学型的特点，为本次新发现类型，1份样品(M461)，含有紫苏醛31.70%、芹菜脑27.08%、D-柠檬烯11.34%。

3.2.2.4 PKPP型 兼有PK型和PP型两种化学型的特点，为本次新发现类型，1份样品(M194-2)，含有紫苏酮12.34%、芹菜脑29.80%、D-柠檬烯15.16%。

3.2.2.5 PAPS型 兼有PA型和PS型两种化学型的特点，为本次发现类型，2份样品(M447、M476)，分别含有紫苏醛28.09%、17.36%，倍半萜类成分氧化石竹烯16.11%、24.40%。

3.2.2.6 PPPS型 兼有PP型和PS型两种化学型的特点，为本次新发现类型，1份样品(M295-1)，β-细辛脑和榄香素分别为19.19%、15.44%，石竹烯和葎草烯分别为32.26%、15.22%。

4 讨论

本研究所用种质材料，主要来自于紫苏的栽培类型，其中的化学型仍然是PK型最多，PA型次之，和本研究组前期结果一致[10-11]，未能发现EK、C和SF等稀有化学型，而是发现了两种新亚型，1份PA-Ⅱ型和3份PT-Ⅱ型。

本研究指定了以倍半萜为主要成分的类型(PS型)和含量相对较高的混合型(PAPS型和PPPS型)。倍半萜类成分在紫苏挥发油中是普遍存在的，其中常以石竹烯含量最高，但一般不超过20%，且其他倍半萜成分较少超过10%，当倍半萜含量特别高的时候，其他单萜或芳香性特征成分含量或者很低时为PS型，较低时且如果二者相比含量差距不大(1∶2～2∶1)时定义为混合型(PAPS型或PPPS型)，这些情况可能是来自于倍半萜代谢途径的上调，或者单萜和芳香类成分代谢途径的下调，是值得关注的新类型。其他新的混合型(PAPP型、PKPP型、PAPT型)的发现也具有重要的价值。本研究表明了中国产紫苏的种质多样性，为紫苏种质的进一步研究和应用提供了珍贵的材料。