枯草芽孢杆菌粗酶液对Cry1Ac蛋白质的降解特性

2019-08-20董震宇曾嵘肖海兵胡志伟

江苏农业科学 2019年9期

董震宇　曾嵘　肖海兵　胡志伟

摘要：为了明确枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）粗酶液对Cry1Ac毒蛋白质的降解特征，采用蛋白质凝胶电泳[十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）]和酶联免疫吸附法（ELISA），在不同溫度和pH值条件下测定该菌粗酶液降解Cry1Ac蛋白质的特性。结果表明，枯草芽孢杆菌主要以胞外酶液降解Cry1Ac蛋白质，胞外粗酶液在 40 ℃、pH值为10的条件下对Cry1Ac蛋白质的降解效果最佳，粗酶液S1对Cry1Ac蛋白质降解的米氏常数（Km）为2.099 4 μg/L，最大反应速度（Vmax）为0.239 58 μg/（L·min）。在降解45 min时，Cry1Ac蛋白质含量由4.987 μg/L降至0.159 μg/L，其降解程度达极显著水平（P<0.01），其降解率为96.815%。枯草芽孢杆菌的胞外酶液主要发挥降解Cry1Ac蛋白质的作用，其粗酶液对Cry1Ac蛋白质的降解最适条件为40 ℃、pH值为10以及Km为2.099 4 μg/L。

关键词：枯草芽孢杆菌;Cry1Ac蛋白质;棉田土壤;降解细菌;降解能力

中图分类号： S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）09-0273-03

转Cry1Ac基因棉产生的Cry1Ac杀虫蛋白质可以降低棉铃虫等鳞翅目害虫的危害程度，减轻农药对环境的污染。因其优势，转Bt基因棉种植面积日趋扩大[1]。但Cry1Ac杀虫蛋白质可经转Cry1Ac基因作物根系分泌物或作物残留等形式进入土壤生态系统，残留于土壤而影响土壤微生物类群和多样性[2]。Cry1Ac蛋白质与土壤颗粒紧密结合不易降解[3]，而转Bt基因棉粉碎还土能促使土壤中细菌和真菌数量显著增加[4]。土壤生态环境具有一定抗风险能力，其土壤微生物可促进Bt蛋白质的降解[5]。新疆阿克苏盐碱地土壤细菌资源丰富，已分离培养盐碱地土壤中的细菌103株[6]，其中分离得到的枯草芽孢杆菌对Cry1Ac蛋白质降解效果明显[7]，但目前对新疆棉田Cry1Ac蛋白质的降解研究较为鲜见。因而对Cry1Ac毒蛋白质降解细菌的降解特征分析将对长期种植转Bt棉田的土壤生态治理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

试验菌株为枯草芽孢杆菌菌株（Bacillus subtilis），由笔者所在实验室分离[7]。[LM]

1.1.2 主要试剂及仪器

蛋白胨和牛肉膏（北京奥博星生物技术有限责任公司）;十二烷基硫酸钠（SDS）、NaCl、H2O2、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、溴酚蓝、甘油、甲醇、无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司）;琼脂（海南省琼海市长青琼脂厂）;丙烯酰胺、过硫酸氨、甘氨酸（电泳级）、冰乙酸和考马斯亮蓝（R250）（天津博迪化工股份有限公司）;三羟甲基氨基甲烷（天津市鼎盛鑫化工有限公司）;N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）（天津市大茂化学试剂厂）;Cry1Ac蛋白质（纯度96%）及其酶联免疫试剂盒（上海佑隆生物科技有限公司）;蛋白质电泳仪（北京六一生物科技有限公司）;恒温恒湿培养箱（宁波赛福实验仪器有限公司）;Sky-1102C型全温度恒温摇床培养箱（上海苏坤实业有限公司）;FC型酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司];超纯水机（成都优普生物科技有限公司）;超声波破碎仪（德国耶拿分析仪器股份公司）。

1.1.3 培养基

NA培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%，pH值为7.2～7.4。NB液体培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH值为7.2～7.4。

1.2 试验方法

1.2.1 降解菌粗酶液的制备及降解酶的定位

取纯培养菌液离心（5 000 r/min，5 min），取上清液（S1）冻存;离心管内加无菌水，冰浴中超声波破碎细胞（工作5 s，间隔5 s，破碎 10 min），离心（5 000 r/min，5 min）后，取上清液（S2）冻存，即S1为胞外酶提取液，S2为胞内酶提取液[8]。将S1和S2酶液分别处理Cry1Ac蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测其酶的降解效果[5]。

1.2.2 降解菌的降解特性研究

检测不同温度对粗酶液S1活性的影响。取S1上清液90 μL于1.5 mL离心管中，然后加入10 μL Cry1Ac蛋白质（5 μg/L），分别于20、25、30、35、40、45 ℃ 的水浴中反应45 min，同时设不加酶液的离心管作为对照处理。同理，检测pH值对酶活性的影响，配制不同pH值的缓冲液，pH值分别设为5、6、7、8、9、10、11，取90 μL不同pH值的S1缓冲液于1.5 mL离心管中，加入10 μL Cry1Ac蛋白质（5 μg/L），40 ℃水浴45 min，分别测定D450 nm[9-10]。

在最适条件下，在离心管内加入90 μL酶液，然后加入不同浓度的Cry1Ac蛋白质标品10 μL，最初的Cry1Ac蛋白质底物浓度分别为0.500、0.625、1.250、2.500和5.000 μg/L，于40 ℃反应 10 min。利用双倒数作图法，求得粗酶液S1对Cry1Ac蛋白质降解的米氏常数Km和最大反应速度Vmax[11-12]。

1.2.3 降解菌株对Cry1Ac蛋白质降解能力的测定

采用酶联免疫吸附法（ELISA）定量分析Cry1Ac蛋白质含量，分析降解菌对Cry1Ac蛋白质的降解作用能力[5]。取S1上清液 90 μL 于1.5 mL离心管中，然后加入10 μL Cry1Ac蛋白质（μg/L），分别在40 ℃、pH值为10.0的条件下反应10、45 min，分别测定D450 nm。

1.2.4 数据处理

利用Cry1Ac蛋白质的标准曲线计算其相应浓度，米氏方程公式为V=（Vmax×[S]）/（Km+[S]）[13]。采用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据处理和Duncan's新复极差分析。

2 結果与分析

2.1 降解酶的定位

在分离的枯草芽孢杆菌S1、S2中，胞外酶液S1无明显电泳条带显示，而胞内酶液S2和对照组均呈现不同亮度的电泳条带（图1）。这说明枯草芽孢杆菌菌株胞外酶S1能明显地降解Cry1Ac蛋白质。另外，Cry1Ac蛋白质标准品和胞内酶液S2处理均在70 ku附近有明显电泳条带，Cry1Ac蛋白质分子质量约为65 ku。

2.2 降解粗酶液S1的酶促降解特性

由图2可知，pH值为10时，枯草芽孢杆菌粗酶液S1处理的Cry1Ac蛋白质含量降至最低值，为0.365 μg/L，与其他各pH值处理相比差异显著（P<0.05）。pH值为6时降解程度次之，Cry1Ac蛋白质含量降为0.417 μg/L，均与其他各处理间差异显著（P<0.05），因此，该粗酶液S1在碱性条件下的最适降解pH值为10，其次为酸性条件下，pH值为6。

由图3可知，40 ℃时，枯草芽孢杆菌粗酶液S1处理的Cry1Ac蛋白质含量降至最低值，为0.387 μg/L，与20、25、30 ℃ 处理相比差异极显著（P<0.01），但与35、45 ℃处理间无明显差异。因此，该粗酶液S1在40 ℃左右时条件较适宜。

由表1可得，一定浓度粗酶液S1，随Cry1Ac蛋白质底物浓度的升高，降解率大体上降低，其Cry1Ac蛋白质底物浓度（x）与Cry1Ac蛋白质剩余浓度（y）的函数关系为y=0.436 2x+0.230 2，r2=0.993 9，回归模型拟合度较好。当Cry1Ac蛋白质底物浓度为0.500、0.625 μg/L时，二者降解率无显著差异，但高于其他处理，达极显著水平（P<0.01）。当Cry1Ac蛋白质底物浓度为1.250 μg/L时，降解率为59.96%，其降解率显著高于2.500、 5.000 μg/L处理组（P<0.05），说明2.500、5.000 μg/L处理组粗酶液S1的降解水平下降幅度较大。

由图4可知，1/底物浓度（x）与1/反应速率（y）的函数关系：y=8.762 8x+4.174 2，r2=0.954 3，回归模型拟合度较高，经计算得Vmax=0.239 58 μg/（L·min），Km=2.099 4 μg/L。

2.3 降解粗酶液S1对Cry1Ac蛋白质降解能力的测定

由表2可知，经降解粗酶液S1处理45 min后，Cry1Ac蛋白质含量由4.987 μg/L降至0.159 μg/L，其降解率为 96.815%，其降解率显著高于10 min处理组，达极显著水平（P<0.01）。

3 讨论与结论

经试验发现，枯草芽孢杆菌胞外粗酶液降解Cry1Ac蛋白质的最适温度为40 ℃，推测该粗酶液具有较好的耐热性。这可能与阿拉尔垦区的气温较高有关[14]。另外，其降解最适降解pH值为10，Cry1Ac蛋白质在碱性条件下易被降解，推测该菌对碱性土壤环境的耐受性较好，这可能与新疆阿拉尔垦区盐碱地有关[6]。但在酸性条件下，pH值为6时的降解效果也比较好，这推测该胞外粗酶液可能存在2种及以上的酶类组成，各自降解酶特性还需进一步分离纯化等研究。因此，粗酶液的最适降解温度为40 ℃，最适pH值为10。Km为 2.099 4 μg/L，Km值相对越小，该粗酶液S1与Cry1Ac蛋白质结合较为亲和。此外，枯草芽孢杆菌菌株粗酶液在最适降解条件下，对Cry1Ac蛋白质处理45 min后，其降解率为 96.82%，这与肖海兵等在37 ℃、1 h条件下降解率为 92.26% 的研究结果[7]相近，其降解活性较高，对Cry1Ac有较好的降解效果。此外，本研究未对重金属等因素的影响进行检测，在土壤综合环境条件下是否也同样具有较高的降解活性有待进一步验证。

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