农业环境领域抗生素抗性基因的文献计量研究

李红娜　叶婧　朱昌雄　耿兵

摘要：为深入了解农业环境领域抗生素抗性基因（ARGs）研究的整体状况和前沿动态，以科学引文索引（science citation index expanded，简称SCI-E）的在线数据库为基础，对1995—2016年期间全球范围内相关的文献报道开展了计量学分析，全面评价了研究内容、研究热点及发展趋势。自2009年开始，农业环境领域中ARGs相关的文献报道迅速增加，研究范围包括污染调研、安全评价、消减机制与扩散等方面。对作者关键词（author keywords）、附加关键词（keywords plus）、题目（title）及摘要（abstract）综合分析的结果表明，当前研究的热点抗生素类型包括四环素类、磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类，它们在未来依然是持续被关注的对象。ARGs相关的热门研究基质包括废水、土壤、地表水、粪便、饮用水等，且我国是相关论文研究最多的区域。根据文献计量分析的结果，ARGs污染引起的微生物群落改变、PCR技术、重金属协同选择抗性、风险评估等是农业环境领域ARGs研究的热门话题。

关键词：农业环境;文献计量;抗生素抗性基因;耐药菌;研究趋势

中图分类号： S-058文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）09-0267-06

近年来，抗生素被广泛应用于保护人类健康、减少疾病、促进养殖畜禽的生长中。由于大多数抗生素都是水溶性的，30%～90%的抗生素在使用后会通过尿液或粪便以母体化合物的形式被释放到环境中，对人类健康和生态系统构成潜在的风险[1]。已有的报道表明，在土壤和废水中，尤其是有集中养殖场的地区附近频繁检出抗生素[2-4]。同时，抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，简称ARGs）成为一类新兴的环境污染物，抗生素耐药性已经被世界卫生组织列为全球健康的三大威胁之一，因其长期存在、基因水平转移行为等更难以从环境中消除，因此近年来在国际上也得到了越来越多的关注[2]。

尽管当前对农业环境领域中抗生素使用、环境行为及降解机制的研究非常多，但是基于全球范围的ARGs情况分析的研究还较为缺乏。为了整体考察农业环境中抗生素抗性基因的相关研究进展，并及时把握其发展态势，获取最有价值的信息，本研究采用文献计量学的方法[3]，综合分析1997—2016年期间全球农业环境领域中有关ARGs的文献标题、作者关键词（author keywords）、附加关键词（keywords plus）、题目（title）、摘要（abstract），以评价其研究现状及发展趋势，以期更好地认识农业环境领域ARGs的研究热点及未来的发展方向。

1 数据来源与分析方法

科学引文索引（science citation index expanded，简称 SCI-E）是美国科学信息研究所的网络科学数据库，是文献计量学分析中最常用和最重要的源数据库。本研究以SCI-E数据库为基础，以“antibiotic resistant gene* or antibiotic resistance gene*”为检索式，Web of Science类别为“Agricultural Engineering or Agriculture Dairy Animal Science or Agriculture Multidisciplinary or Agronomy or Engineering Environmental or Environmental Sciences or Soil Sciences or Water Resources”，共查到2 131篇文献（1995年1月1日至2016年12月31日为时间节点）。这些文献同时包含了与“antibiotic resistant gene”“antibiotic resistant genes”“antibiotic resistance gene”“antibiotic resistance genes”等有关的内容，下载的内容涵盖了所有文献的作者姓名、通信地址、标题、发表年份、作者关键词、附加关键词、摘要以及发表期刊的名称等信息。利用Excel、SPSS等软件对论文的年度发表数量变化、类别分布、研究机构、作者进行分析;利用词组聚类分析法[3]对作者关键词及附加关键词进行分隔确定，之后按照4个阶段（1997—2001年、2002—2006年、2007—2011年、2012—2016年）统计主要关键词的出现频次并排序;最后，將作者关键词、附加关键词、论文题目、摘要等信息作为1个整体统计主要关键词的出现频次并排序，以评价当前的研究热点以及未来的研究趋势。将具有相同或相近含义的词或词组统一合并成为1个关键词，比如，“antibiotic resistance*”代表“antibiotic resistance gene”“antibiotic resistant gene”“antimicrobial resistant”“antibiotic resistant”“multi-resistant”“drug resistant”等，“wastewater*”代表“waste waters”“waste-water”“sewage water”“poultry wastewater”等，“tetracycline*”代表“tetracycline”“oxytetracycline”“chlortetracycline”等。

2 结果与分析

2.1 论文发表数量、方向及作者分析

由图1可见，近年来与农业环境领域ARGs相关的研究报道数量增加极快，自1995年的19篇逐渐上升到2016年的376篇。自2009年起，农业环境领域中抗生素相关的文献数量明显增多，单篇文献的被引次数最高点出现在2003年。同年来自德国罗斯特克大学的Thiele-Bruhn首次对土壤中抗生素的投入情况及其环境行为进行了综述研究，并且指出，土壤中抗生素的寿命和转移机制与其中的微生物群落密切相关，抗生素的存在会造成土壤环境中耐药微生物的暴发，当含有耐药基因的病原体通过基因迁移的途径进入到人体或动物体内时，就会造成常规药物治疗所不能解决的严重问题[4]。正是基于这些结论，在农业环境中有关ARGs的污染调研[5-7]、安全评价[8-9]、消减途径[10]、扩散机制[11-12]等方面的研究陆续展开。

文献计量分析的结果表明，研究时间范围内农业环境领域ARGs的相关文献分布于236个不同的期刊中，其中Science of the Total Environment的发文量最多（153篇，8.1%），其次是Environmental Science and Technology（129篇，6.9%）、Water Research（108篇，5.7%）、Environmental Science and Pollution Research（81篇，4.3%）和Chemosphere（73篇，3.9%）。在1995—2016年期间，来自中国香港大学的张彤老师发表的SCI文章数最多（32篇，0.32%）;来自葡萄牙天主教大学的Manaia发文量次之（24篇，0.24%）;来自美国科罗拉多州立大学大学的Pruden（23篇，0.23%）、中国南开大学的罗义教授（22篇，0.22%）发文量紧随其后。在所有作者中，有 5 738位（总作者数的56.51%）在1995—2016年期间仅发表了1篇文章。

2.2 作者关键词分析

近2年内有关文献计量的文章不断增多，但是有关研究趋势的报道还比较缺乏。1997—2016年间，农业环境领域ARGs相关的研究论文共有1 564篇，其中有1 301篇（83.2%）含有作者关键词。以此为基础，每5年作为1个阶段，对其中的作者关键词进行计数并排序，由表1可知，使用较频繁的关键词包括抗生素耐药性（Antibiotic resistance*）、废水（Wastewater*）、四环素类（Tetracycline*）、大肠杆菌（Escherichia coli*）、地表水（Surface water*）等。废水、四环素类、地表水、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等在第1个5年阶段（1997—2001年）中均未出现，但是在接下来的15年间关注度逐步提高，在2012—2016年间已经分别提升到第3（4.05%）、第4（2.32%）、第9（1.20%）、第8（1.27%）。抗生素的大量使用會通过ARGs的水平迁移行为造成耐药菌的迅速繁殖，从而对人类和动物健康产生威胁，尽管自1969年起Swann委员会就指出抗生素会产生交叉抗性，因此不适合作为生长促进剂使用，欧盟在2006年就明令禁止将抗生素作为生长促进剂，但是关于其抗性促进的争论仍在持续进行[9]。Phillips等提出，抗生素的使用在很多情况下造成的风险极小甚至几乎为零[13]，但是现在越来越多的试验表明，由于抗性基因的存在使得抗生素、耐药菌、动物和人体之间的关联越来越紧密[9]。

通过对作者关键词的分析发现，ARGs是水、土环境中的研究热点;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌（Enterococcus*）、沙门氏菌（Salmonella*）等是与ARGs研究主要相关的微生物类型;四环素、喹诺酮（Quinolone*）类是较热点的抗生素类型;此外，PCR、微生物多样性（Microbial community*）、重金属（Heavy metal*）、风险分析（Risk assessment*）等也是出现次数较多的作者关键词。许多国家的水环境监测数据表明，天然水体中能检出超过30种抗生素，在污水处理厂的进出水甚至地下水和饮用水中也能检测到抗生素。抗性菌和多重抗性菌会通过有机肥料的施用或废水回灌等方式进入水体中，因此，水体是ARGs传播和扩散的重要介质[6，12]。土壤类型、气候条件、抗生素的理化性质等是决定抗生素在土壤中迁移转化行为的重要因素。随有机肥进入农田的抗生素（如四环素等）通过与钙离子等结合形成双价态阴离子结构而在土壤环境中富集并持久存在，进而使土壤微生物在受抗生素污染后产生耐药性。在瑞典和荷兰的多个土壤样样品中检测出高比例可同时耐受多种类型抗生素的耐药菌[9]。

大肠杆菌是一种常见的致病菌，抗生素长期大量的应用导致了大肠杆菌耐药菌株的出现，且不断有报道发现多重交叉耐药大肠杆菌。这不仅增加了相关治疗的难度，更造成了动物源性食品的安全问题[14]。因此，大肠杆菌耐药性问题引起了全球的广泛关注，在作者关键词中，相关的研究报道数量从1997—2001年第1个5年阶段的第7（0.77%）逐步增加到2012—2016年第4个5年阶段的第5（2.06%）。同时，各国学者对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌耐药性的探索也从未停止，并从多方面阐述了抗性基因的污染和扩散机制[15]。

进入环境中的抗生素除了会使细菌获得抗性基因外，还会对水土环境中的微生物多样性造成严重扰动。Shi等的研究结果表明，水体中变形菌门细菌的丰度会随着抗生素耐药菌的增加而增大，进一步荧光定量PCR的分析结果显示，sulI在所有检测到的ARGs中相对丰度最高，其次为tetA和tetG[16]。有关微生物群落（Microbial community*）研究的报道数量在1997—2001年第1个5年阶段近排名第19（0.38%），在近20年来也呈现出迅速上升的趋势，到2012—2016年第4个5年阶段就达到了第7（1.29%）。

除四环素类抗生素外，磺胺类和喹诺酮类也是研究较多的抗生素类型。此外，重金属也是农业环境中重点关注的污染物。基于细菌耐药性问题而广泛应用的重金属抗菌剂，造成了环境中抗生素与重金属离子的协同选择抗性污染[17]，通过对作者关键词的分析表明，农业环境领域中与ARGs相关的重金属研究文章数在2007年之前为零，在2012—2016年第4个5年阶段中排名第14（0.94%），说明研究抗生素与重金属的复合污染对于准确评价两者的迁移转化和毒性效应具有更实际的意义。

2.3 附加关键词分析

附加关键词是从施引文献的题目及备注等信息中挖掘的关键词，对原始的题目关键词与作者关键词提供补充和完善的作用。在1997—2016年期间发表的1 564篇与农业环境领域抗生素相关的研究论文中，有1 540篇（98.5%）含附加关键词（表2）。

污水处理厂（Treatment plant*）是环境中抗生素排放的热点区域，同时污水（Wastewater*）和污泥（Activated sludge*）是抗性基因和耐药菌存在的主要位置[12]。尽管污水在附加关键词分析的第1个5年阶段中没有出现，但是自2002年开始相关的研究报道迅速增多，到第4个5年阶段2012—2016年发表的文章数量就已经达到了第2（3.81%）。对污水处理工艺如生物技术、高级氧化和消毒等中抗生素、抗性基因和耐药菌的研究表明，抗生素和耐药菌与水体的毒性效应紧密相关，同时抗生素存在会促进抗性基因和耐药菌的选择。综合考察抗生素的理化性质和关键技术的参数效果，污水处理厂的主要工艺能够达到去除废水中抗生素的目的，但是目前关于这些工艺对ARGs和耐药菌的影响研究还较为缺乏。高级氧化技术和消毒工艺被认为是控制环境中ARGs的主要手段，但是关于耐药菌和ARGs在污水处理厂富集的风险评估、ARGs在废水环境中富集和选择存在的驱动因素和机制等方面的研究还亟待开展。

PCR和光谱测定法（Spectrometry*）代表了与ARGs相关的检测分析方法。PCR是检测抗性基因是否存在以及移动元件是否贡献基因水平迁移等内容所必备的关键技术。与抗菌谱相比，它不仅能鉴定（Identification*）同源DNA标记，也能同时检测到多种抗性基因标记和毒力基因，因此更能准确地跟踪环境中相关抗性基因的传播扩散行为[9]。但是，无论是基于平板培养的传统方法还是基于分子生物学技术的PCR方法，都不可能完全覆盖可扩散传播的所有ARGs，因此Lupo等提出，通过检测控制ARG存在的移动元件比直接检测ARG自身更能准确地鉴定ARGs污染扩散的热门区域[18]。整合子（Integron*）由于具有构成简单、具有共同结构特征、与其他转移原件有关联以及能够高效捕获ARG等特点而成为检测ARGs污染扩散的最佳研究目标。此外，附加关键词中的光谱法（Spectrometry*）包括了串联质谱（Tandem Mass Spectrometry）、色谱-质谱联用（Chromatography- Mass Spectrometry）等与抗生素检测相关的技术手段，常用的环境样品中抗生素的检测方法通常包括酸性缓冲液的萃取与液相色谱-质谱仪的联合分析[4]。

有关中国（China*）的研究在前2个5年阶段中没有出现，但是相关文章数目自2007年开始迅速上升，到第4个5年阶段2012—2016年就达到了第9（1.28%），这表明科研人员对中国农业环境领域抗生素抗性基因现状的关注。中国是世界上抗生素产量最大的国家，年产抗生素达到21万t，Luo等对海河流域72 km范围内水体的检测数据表明，有8种抗生素的浓度比当地的污水处理厂出水浓度高出1～2个数量级，且磺胺类抗生素的浓度在该流域最高[19]。随着中国政府对农业环境质量的重视和关注度的提高，有关抗生素限制使用等政策将进一步完善，这必将对ARGs等的控制工作起到积极的促进作用。

2.4 研究熱点分析

研究热点分析是将文章标题、作者关键词、附加关键词、摘要综合起来进行聚类分析，以使分析结果更全面可靠[3]。

其中，含义相似或相近的单词、短语会合并成1个词组，并进行统一的分组和排序。图2中所列出的词语包含了它们的单复数形式、简称、其他时态格式以及含义相近的词语。

ARGs研究的热点介质主要包括废水（wastewater）、土壤（soil）、地表水（surface water）、污泥（sludge）、粪便（manure）、饮用水（drinking water）等（图2-a）。如“2.3”节中所述，污水处理厂是环境中抗生素排放的重点区域，同时污水和污泥也是抗性基因和耐药菌的“汇”，因此相关的研究报道一直较多。土壤环境中抗生素的归趋和迁移是环境化学学科领域的1个新兴研究方向，相关的文章数量在近10年来表现出迅速增加的趋势。据报道，通过施肥进入环境中的抗生素浓度可以达到mg/hm2的级别，其在土壤中的环境行为随分子结构、分子大小、存在形态、溶解度、疏水性以及吸附和固定作用大小的不同而不同[9]。随着2002年美国地质调查局的

[FK（W22][TPLHN2.tif;S+2mm]

Kolpin等首次对美国全国范围内天然水体中抗生素、激素及其他污染物的分布及浓度清单开展调研和定量检测[20]，这些有机污染物特别是低浓度抗生素的长时间的低剂量暴露对动植物、对饮水安全、对人体健康所带来的慢性影响逐步引起了进一步深入的研究。

研究的热点抗生素类型包括四环素类（tetracyclines）、磺胺类（sulfonamides）、喹诺酮类（quinolones）、大环内酯类（macrolides）等（图2-b）。我国是四环素类抗生素生产、销售、使用大国，已有的研究数据表明，在北京、天津、浙江、上海等省（市）多个养殖场的土壤和畜禽粪便中四环素类浓度在 10～510 mg/kg之间，总体来看，我国畜禽粪便中四环素类抗生素残留量显著高于发达国家[21]。2013年我国磺胺类抗生素的生产量达12.12万t[22]，其使用量仅次于四环素类，使用较多的种类包括磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嘧啶以及磺胺甲唑等。此外，氟喹诺酮类、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素等喹诺酮类抗生素和红霉素、泰勒菌素等大环内酯类抗生素也是在农业环境领域检测到较多的抗生素类型。因人类自身或在农业活动中使用抗生素造成水土环境中ARGs丰度远高于未受污染的天然环境。基于卡罗拉多北部地区ARGs的调研结果表明，养牛场废水池和排污沟渠中检测到的2种四环素抗性基因tetW和tetO，同时存在于附近的饮用水源和再生废水中，表明它们可以通过基因迁移的途径在人类和其他生物体间传播，进而对环境安全和人类健康造成更大的威胁[11]。因此，环境领域中ARGs的传播污染问题需要引起科学家和工程师们的特别关注。

在研究区域上，对中国（China）农业环境领域的ARGs研究热度整体高于美国（USA）、印度（India）和非洲（Africa）等国家。从图2-c中可以看出，美国第1篇相关的报道出现在1995年，报道了由于缺乏有效的污水处理设施导致美国和墨西哥交界处的地下水受到抗生素类物质和耐药菌污染的问题[23]。尽管中国的研究起步较晚（2005年），但是近6年来的相关报道数量飞速地增长。这主要是由于中国作为抗生素生产和使用大国，对影响抗生素和ARGs在环境中迁移和传播的环境行为研究还较为缺乏，对环境中抗生素和耐药菌的时空分布多样性积累的数据还较少[19]。随着国家对抗生素问题重视程度的加大，特别是ARGs作为21世纪人类面临的三大重要挑战之一，有关农业环境特别是中国农业环境中ARGs的污染现状、迁移途径、去除效果和机制等方面的研究陆续开展起来。

關键词分析的结果表明，农业环境领域ARGs的热点研究话题包括微生物群落（microbial community）、PCR、重金属（heavy metal）、整合子（integron）以及风险评估（risk assessment）等（图2-d）。微生物是表征环境质量最有潜力的敏感性指标，高质量的土壤或水体应具有稳定的微生物群落组成和结构、高微生物生物量及良好的微生物活性。已有的研究还表明，进入到环境中的抗生素在使土壤和水体产生更强抗性的同时，还会显著影响环境本身的微生物群落组成;即使是低于抑菌剂量水平的抗生素如磺胺二甲嘧啶，随粪便进入土壤中后也会造成其中微生物活性的降低，特别是使其氮转化相关功能受到抑制[24]。近年来农业环境领域ARGs相关的研究多集中于受ARGs污染的土壤和水体，借助PCR等工具鉴定抗性基因是否存在，借助qPCR确定抗性基因的环境丰度，并进一步研究其对天然环境微生物群落的影响和扰动的机制，将有助于明确环境中ARGs传播和扩散的过程，寻找解决耐药性污染难题的技术措施。除了抗生素及ARGs外，重金属也是农业环境领域中的一大类特殊污染物，重金属-抗生素复合污染及其所造成的协同抗性等问题逐渐得到关注[17]。此外，弯曲菌、大肠杆菌等耐药菌可以引发多种流行病，严重影响食品安全和人体健康，相关方面的风险评估一直是农业环境领域的研究热点，因此近年来的研究报道持续增加。

2.5 高被引论文分析

文章的影响力可以通过每年的被引次数来追踪和评价[3]。表3列出了截至2016年引用次数最多的10篇文章，其中2篇发表于《Environmental Pollution》（影响因子为5.099），其余8篇分别发表于《Journal of Plant Nutrition and Soil Science》（影响因子为2.102）、《Ecological Indicators》（影响因子为3.898）、《Chemosphere》（影响因子为4.208）、《Environmental Science and Technology》（影响因子为6.198）、《Journal of Hazardous Materials》（影响因子为6.065）、《Science of the Total Environment》（影响因子为3.976）、《Water Research》（影响因子为6.942）和《Plant and Soil》（影响因子为3.052）。其中，《Pharmaceutical antibiotic compounds in soils-a review》发表于2003年的《Journal of Plant Nutrition and Soil Science》，尽管期刊影响因子不高，但是该篇论文的被引用次数最多，截至2016年年底已经达到544次。该文章对全球范围内抗生素物质的用量和分布、土壤样品的提取方法和检测技术、抗生素在土壤介质中的环境行为（吸附和固定、移动和迁移、降解和失活）、土壤中抗生素对土壤微生物群落及植物的影响，特别是对土壤ARGs的贡献和土壤中耐药微生物的投入等进行了全面的综述，最后提出了对环境中抗生素和ARGs迁移转化行为和有效性的研究、ARGs污染土壤的生物毒性评估技术研究以及降低抗生素和ARGs环境风险的政策管理机制建立等方面的需求。该文章自发表以来，每年的被引次数都较高，在2016年仍达到58次，说明科研人员对天然环境中抗生素和ARGs影响的关注度较高。

尽管发表的时间较晚，但是Kemper[9]、Luis Martinez[25]、Lapworth等[26]、Michael等[12]所发表的文章在2016年的被引次数分别为99、97、103、101次，这体现了研究人员对水土环境中ARGs存在、迁移以及健康风险等问题的关注。这10篇文章主要覆盖了水环境（天然水体、地下水、污水处理厂水体等）、土壤环境（农田土壤、根际土壤等）中抗生素、耐药菌和ARGs的环境污染研究，通信作者单位依次为德国罗斯托克大学、德国基尔大学、西班牙国家研究委员会、德国弗莱堡大学医学中心、美国科罗拉多州立大学、瑞典哥德堡大学、英国地质调查局、美国威斯康星大学、塞浦路斯大学以及荷兰瓦赫宁根大学。

3 结论

对Web of Science数据库收录的全球范围内农业环境领域抗生素抗性基因相关研究论文的分析表明，近年来与ARGs相关的论文数量快速增多，研究范围包括污染调研、安全评价、消减机制与扩散研究等方面。进一步对论文题目、作者关键词、附加关键词、摘要等的统筹分析表明，当前与ARGs相关的热点抗生素类型包括四环素类、磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类，它们在未来依然是持续被关注的对象。ARGs相关的热门研究基质包括废水、土壤、地表水、粪便和饮用水等，且中国是相关论文研究最多的区域。根据文献计量分析的结果，ARGs污染引起的微生物群落改变、PCR技术、重金属协同选择抗性、风险评估等是农业环境领域ARGs研究的热门话题。

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